CRISPR) üçüncü nəsil genom redaktə texnikasıdır: CRISPR dünyanı inqilab etdi

Klasterləşdirilmiş müntəzəm olaraq aralıqlarla qısa palindromik təkrarlar (CRISPR), yüksək məhsuldarlığı ilə dünyanı inqilab edən üçüncü nəsil genom redaktə texnikasıdır. Müxtəlif bioloji xəstəliklərin və infeksiyaların müalicəsində istifadə edilmişdir. Müxtəlif bakteriyalar və digər prokaryotlar (məsələn, arxeya) da faqlardan qorunmaq üçün CRISPR/Cas9 sistemlərinə malikdir. Bildirilib ki, CRISPR/Cas9 əsaslı strategiyalar potensial olaraq dəyişdirilmiş müqavimət genlərini, transkripsiyanı və epigenetik tənzimləməni hədəf alaraq üçqat mənfi döş xərçənginin (TNBC) böyüməsini və irəliləməsini maneə törədə bilər. Bu terapevtik müdaxilələr hətta TNBC-də müşahidə olunan dərman müqaviməti kimi çətin problemlərin həllinə kömək edə bilər. Hal-hazırda, CRISPR/Cas9-u hədəf hüceyrələrə çatdırmaq üçün müxtəlif üsullar, məsələn, fiziki (mikroinyeksiya, elektroporasiya və hidrodinamik rejimlər), viral (adeno ilə əlaqəli virus və lentivirus) və qeyri-viral (liposomlar və lipid nanopartikülləri) istifadə olunur. )-partiküllər). TNBC-nin molekulyar səbəblərini öyrənmək üçün müxtəlif modellər hazırlansa da, in vivo genom redaktə vasitələrinin təqdim edilməsi üçün həssas və hədəflənmiş metodların olmaması onların klinik tətbiqini məhdudlaşdırır. Xülasə, bu icmalda mövcud dəlillərə əsaslanaraq TNBC üçün CRISPR/Cas9 müalicəsinin irəliləyişi, çətinlikləri, məhdudiyyətləri və perspektivləri hərtərəfli araşdırılır. Həmçinin, süni intellekt və maşın öyrənməsinin kombinasiyasının TNBC-nin müalicəsində CRISPR/Cas9 strategiyalarını necə təkmilləşdirə biləcəyini vurğulayırıq.
Xərçəng nəzarətsiz hüceyrə bölünməsi, hüceyrə dövrünün yoxlama nöqtələrinin pozulması və şiş basqılayıcı genlərində (TSG) mutasiyalar ilə xarakterizə olunur (Matthews və b., 2022). Müxtəlif xərçəng növləri arasında döş xərçəngi qadınlarda ən çox yayılmış xərçəng növüdür və dünyada yüksək ölüm nisbətinə malikdir (Waks və Winer, 2019). Döş xərçəngi histoloji və bioloji xüsusiyyətlər, klinik təzahür və davranış, eləcə də müalicəyə cavab kimi müxtəlif xüsusiyyətlərə malik heterojen bir xəstəlikdir (Weigelt və b., 2010). Döş xərçənginin təsnifatı döş xərçənginin diaqnozu və şiş proqnozu üçün dəqiq məlumat verir. Ümumi biomarkerlərin və klinikopatoloji xüsusiyyətlərin istifadəsi döş xərçənginin təsnifatı üçün əsas meyar olmuşdur (Tsang və Tse, 2019). Döş xərçənginin proqnozu və müalicəyə cavabı estrogen reseptorunun (ER), progesteron reseptorunun (PR), insan epidermal böyümə faktoru reseptoru 2-nin (HER2/neu) olması və histoloji dərəcəsi, şiş növü və dərəcəsi daxil olmaqla bir çox amillərdən təsirlənir. ölçüsü və limfa düyünlərinin metastazı (Əl-Tubaiti, 2020). Döş xərçənginin beş daxili molekulyar alt tipi müəyyən edilmişdir, o cümlədən lüminal A, lüminal B, HER2 ilə zənginləşdirilmiş, bazal-bənzər və klaudin-aşağı (Prat və b., 2015). TNBC, bütün ER, PR və HER2-ni ifadə etməyən bir xərçəngin molekulyar alt tipidir (Yin və b., 2020). Bu patoloji xüsusiyyətlər TNBC ilə əlaqələndirilir ki, bu da onun sürətli irəliləməsini və digər döş xərçəngi növlərindən daha aqressiv təbiətini təsdiqləyir (Feng və b., 2018). Bundan əlavə, Peru və b. (2000) döş xərçəngini yenidən təsnif etmək və döş xərçənginin beş daxili alt tipini müəyyən etmək üçün mikroarray texnologiyasından istifadə etmişdir (Cadenas, 2012). Bazal-bənzər döş xərçəngi, üçqat mənfi fenotipə malik və sürətli irəliləmə ilə əlaqəli olan döş xərçənginin bir alt tipidir. Qeyd etmək lazımdır ki, bütün bazal formalı döş xərçənglərinə adətən səhvən TNBC diaqnozu qoyulur, lakin yalnız 77%-i TNBC-dir; Bunun əksinə olaraq, TNBC-lərin 71-91%-i bazal formalıdır ki, bu da bu iki növ döş xərçənginin üst-üstə düşdüyünü və fərqli təsnifatları təmsil etdiyini göstərir (Wang D.-Y. və b., 2019). Bu, proqnozu aydınlaşdırmaq və mövcud və gələcək müalicələrə potensial cavabları müəyyən etmək üçün TNBC-nin heterojenliyini xarakterizə etmək ehtiyacını yaradır. Bundan əlavə, TNBC bütün döş xərçəngi hallarının 15-20%-ni təşkil edir və 50 yaşdan kiçik qadınlarda daha çox yayılmışdır. BRCA1 və ya BRCA2 mutasiyaları TNBC hallarının təxminən 20%-də bildirilmişdir (Xie və b., 2017; Tzikas və b., 2017). , 2020). Tədqiqatlar həmçinin göstərir ki, TNBC-nin yüksək səviyyədə damar endotel böyümə faktorları, şişlə əlaqəli makrofaqlar (TAM), şişə infiltrasiya edən limfositlər (TIL) və şişin böyüməsi və miqrasiyasında iştirak edən digər molekulları əhatə edən fərqli bir immun mikro mühiti var. Buna görə də, TNBC-nin mikro mühitinin başa düşülməsi onun proqnozu və müalicəsi üçün vacibdir (Fan və He, 2022).
TNBC-nin proqnozunu qiymətləndirmək və effektiv müalicəni təmin etmək üçün əsasən ER, PR və HER2-ni aşkar etmək üçün immunohistokimyaya (IHC) və döş neoplazmalarını aşkar etmək üçün mammoqrafiyaya əsaslanan dəqiq diaqnoz vacibdir. Lakin, mammoqrafiya nekroz və fibroz kimi şişdaxili xüsusiyyətləri kifayət qədər təsvir edə bilmir (Deepak Singh və b., 2021). Zəif proqnoz və diaqnoz həkimlərin düzgün dərmanlar təyin etməsinə mane olduğundan (Chaudhary, 2020), TNBC xəstələrinə qulluq yaxşılaşdırmaq üçün müxtəlif strategiyalardan istifadə olunur. Hal-hazırda, TNBC xəstələrində iki dərman, doksorubisin və siklofosfamid istifadə olunur və yaxşı nəticələr göstərib. Bundan əlavə, karboplatin və sisplatin kimi digər platin dərmanları istifadə olunur (Sikov və b., 2015). Bundan əlavə, Olaparib, Velaparib və PF-01367338 kimi PARP inhibitorları TNBC-nin müalicəsi üçün potensial kemoterapi dərmanları kimi istifadə edilmişdir (Ishino və b., 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH və Hedgehog siqnal yollarının TNBC-nin yaranmasında və irəliləməsində iştirak etdiyi bildirildiyindən, dərmanların bu yollara yönəldilməsi vacib bir strategiya ola bilər (Aysola və b., 2013). Cərrahiyyə, şüa terapiyası və kimyaterapiya bu gün TNBC üçün müalicənin əsasını təşkil etsə də, hədəflənmiş terapiya, immunoterapiya, Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12 kimi müxtəlif CRISPR ilə əlaqəli gen redaktə alətləri, əsas redaktə və CRISPR/Cas9 hədəflənmiş gen terapiyası daxil olmaqla yeni müalicələrin hazırlanmasında əhəmiyyətli irəliləyişlər əldə edilmişdir. Burada TNBC-nin müalicəsində istifadə edilən müxtəlif CRISPR ilə əlaqəli gen redaktə alətlərinə diqqət yetirəcəyik. Bunların arasında CRISPR/Cas9 geniş diqqət çəkib.
Cas9n, həmçinin Cas9 nikazası kimi də tanınır, CRISPR/Cas9 genom redaktə sistemindən əldə edilən Cas9 zülalının genetik olaraq dəyişdirilmiş bir variantıdır (Gupta və b., 2019). Orijinal formasında Cas9 zülalı iki nukleaza domenini ehtiva edir: RuvC və HNH, bunların əsas funksiyası hər iki DNT zəncirinin parçalanmasıdır. Lakin, Cas9n-da nukleaza domenlərindən biri olan HNH genetik olaraq mutasiyaya uğrayır və qeyri-aktiv hala gəlir. Buna görə də, Cas9n-ın HNH domeni funksional deyil. Yalnız RuvC domeni aktiv qalır və bu da Cas9n-un tək DNT zəncirlərində kəsiklər yaratmasına və ya qırılmalar yaratmasına imkan verir (Trevino və Zhang, 2014). Cas9 ilə müqayisədə Cas9n hədəfdən kənar təsirləri effektiv şəkildə azalda və hüceyrə təmiri mexanizmlərini dəqiq şəkildə təkmilləşdirə bilər. Cas9n, ikiqat zəncirli DNT-də müəyyən yerlərdə qırılmalar yaratmaq kimi müxtəlif problemləri həll etmək üçün istifadə edilə bilər. Bu məqsədlə iki Cas9n molekulu birləşdirilərək birlikdə istifadə edilmişdir (Yee, 2016). Qarışıq xətt kinaz 3 (MLK3), TNBC metastazı zamanı əsas tənzimləyici rolunu oynayan mitogenlə aktivləşdirilmiş protein kinazdır (Cronan və digərləri, 2012).
MLK3 TNBC metastazına səbəb olan birdən çox siqnal yolunu aktivləşdirə bilər. Məsələn, c-Jun N-terminal kinaz (JNK) yolu hüceyrə hərəkətliliyini və hüceyrədənkənar matrix deqradasiyasını tənzimləyir və MLK3 JNK yolunu aktivləşdirir, bununla da hüceyrə hərəkətliliyini artırır və invaziv xüsusiyyətlər verir (Rattanasinchai və Gallo, 2016). MLK3 həmçinin EMT-ni tənzimləyir. Bunu etmək üçün Snail, Slug və Twist kimi aşağı axın transkripsiya amillərini aktivləşdirir. Bu amillər epitel markerlərinin ifadəsini maneə törədir və mezenximal markerlərin ifadəsini təşviq edir və metastatik fenotipin əldə edilməsinə səbəb olur (Casalino və b., 2023). MLK3-ün ECM-in yenidən qurulmasında və ECM-i deqradasiya edən matriks metalloproteinazalar (MMP) kimi proteazların aktivləşməsində rol oynadığı müşahidə edilmişdir. Bu, şiş hüceyrələrinin invaziyasını və uzaq yerlərə yayılmasını asanlaşdırır (Katari və b., 2019). Beləliklə, əvvəlki tədqiqatlar MLK3-ün TNBC-də kritik rol oynadığını göstərmişdir. Rattanasinchai və Gallo MLK3-ün rolunu öyrənmək üçün TNBC modellərindən istifadə etdilər və onun müəyyən siqnal yolları vasitəsilə xərçəngin inkişafını təşviq etdiyini aşkar etdilər. Onlar MLK3-ü redaktə etmək üçün CRISPR/Cas9n-dən istifadə etdilər və TNBC metastazında əhəmiyyətli dərəcədə azalma müşahidə etdilər (Rattanasinchai və Gallo, 2016).
Tez-tez qeyri-aktiv Cas9 adlandırılan dCas9, Cas9 zülalının modifikasiya olunmuş törəmə formasıdır. Aktiv Cas9-dan fərqli olaraq, dCas9 endonükleaza aktivliyinə malik deyil və bu da DNT-nin ikiqat zəncirli qırılmalarına səbəb ola bilmir. Buna görə də, dCas9, DNT ardıcıllığında heç bir dəyişiklik və ya modifikasiya olmadan genomun müəyyən bölgələrini dəqiq hədəfləmək üçün istifadə edilə bilər (Wang və b., 2016). dCas9-da iki endonükleaza zülalı, RuvC və HNH, vacib amin turşusu qalıqlarını basqılamaqla inaktivləşdirilir. (Richter və b., 2016). DNT parçalanma aktivliyinin olmamasına baxmayaraq, dCas9 genetik tədqiqatlarda və biotexnologiyada bir sıra mühüm rol oynayır. Məsələn, genomun müəyyən bölgələrinin vizuallaşdırılmasına imkan verir, transkripsiya tənzimlənməsini asanlaşdırır və epigenetik modifikasiyaları təşviq edir (Brocken və b., 2018).
Transkripsiya faktoru ZEB1 (sink barmaq E-qutusu bağlayan homeobox 1), embrional inkişaf, toxuma bərpası və xərçəngin irəliləməsi zamanı baş verən hüceyrə prosesi olan epitelial-mezenximal keçidin (EMT) vasitəçiliyində spesifik və kritik rol oynayır. Bu, epitel hüceyrələrinin mezenximal hüceyrələrə çevrilməsini əhatə edir və nəticədə hüceyrə morfologiyasında, hərəkətliliyində, invazivliyində və s. dəyişikliklərə səbəb olur (Wu və b., 2020). ZEB1, TNBC-də epitel hüceyrələrinin hüceyrə-hüceyrə adgeziyasını və polyarlığını qorumaqdan məsul olan E-kadherin və Okkludin kimi çoxsaylı epitel markerlərini inhibə edir (Moreno-Bueno və b., 2008). Bundan əlavə, ZEB1 N-kadherin, vimentin və fibronektin kimi müəyyən markerləri aktivləşdirir (Konradi və b., 2014) və həmçinin Rho GTPazaları və matrix metalloproteinazaları (MMPs) kimi sitoskeletin yenidən qurulmasında iştirak edən genləri tənzimləyir (Huang). və b., 2014). 2022), bundan əlavə, o, həmçinin müxtəlif siqnal yollarına, məsələn, transformasiya edən böyümə faktoru-β (TGF-β), Wnt siqnalizasiyası və s. təsir göstərir və bununla da TNBC-də şiş invaziyasını və metastazını təşviq edir (Chen və b., 2016). Çoxsaylı tədqiqatlar və elmi dəlillər göstərir ki, ZEB1 TNBC-nin aşkarlanması və terapevtik müdaxiləsi üçün dəyərli agent kimi böyük potensiala malikdir. Bu yaxınlarda aparılan bir araşdırmada Waryah və b. bir TNBC modelindən istifadə etdilər və dCas9 tərəfindən ZEB1-in tam yatırılmasına nail oldular. Beləliklə, onlar in vivo şəraitdə çox yüksək spesifiklik və ZEB1-in demək olar ki, tam inhibisiyasını müşahidə etdilər (Waryah və b., 2023).
CRISPR/Cas12, CRISPR/Cpf1 adlı bir gen redaktə vasitəsidir. Bu sistem, Cas12 termininin Cas9-a tamamilə bənzəyən CRISPR ilə əlaqəli zülal 12-yə aid olduğu CRISPR/Cas sistemindən götürülmüşdür (Bharathkumar və b., 2022). Yeganə fərq, tərkibində Cas12 zülalının olmasıdır. Cas9 ilə müqayisədə, Cas12, gen redaktə prosesi zamanı yapışqan uclar yaratmaq kimi bəzi unikal funksiyalara malikdir, Cas9 isə küt uclar yaradır (Wang və b., 2021). Cas12-nin bu xüsusiyyəti onun spesifik DNT manipulyasiya texnologiyasına töhfə verir. Hədəf DNT-ni dəqiq tanıya və kəsə bilən bir zülal olaraq, fövqəladə çox yönlülüyə malikdir və bu da onu gen redaktə də daxil olmaqla müxtəlif tətbiqlər üçün təsirli bir vasitəyə çevirir (Pickar-Oliver və Gersbach, 2019).
Digər CRISPR variantlarına bənzər şəkildə, CRISPR/Cas12 də TNBC-də genləri sıradan çıxarmaq və ya aktivləşdirmək qabiliyyətinə malikdir, patogenezində və ya müalicəyə reaksiyasında mühüm rol oynayan genləri hədəf alır (Yang və Zhang, 2023). Bu prosesi yerinə yetirmək üçün Cas12-ni hədəf geninə yönəldən bir bələdçi RNT (gRNT) hazırlanmışdır. Cas12 hədəfinə bağlandıqdan sonra DNT-də ikiqat zəncirli fasilələr yaradır və DNT təmir mexanizmlərini aktivləşdirir. Təmir prosesi zamanı səhv nukleotidlər daxil ola bilər ki, bu da gen mutasiyalarına və funksiyanın itirilməsinə səbəb olur (Zhang və b., 2021a). Bundan əlavə, genləri aktivləşdirmək üçün Cas12 fermentinin təkmilləşdirilmiş versiyası (dCas12 adlanır) da istifadə edilmişdir. Onu transkripsiya aktivatoru ilə birləşdirərək müəyyən genləri induksiya etmək və bununla da onları aktivləşdirmək mümkündür. Bu texnologiya şiş basqılayıcı genlərinin aktivləşməsini təşviq etməkdə böyük potensiala malikdir (Sultan və b., 2022).
Prime editing yeni hazırlanmış və olduqca üstün bir genom redaktə texnologiyasıdır. O, orqanizmin DNT-sini çox dəqiq şəkildə modifikasiya etməyə qadirdir (Chen və Liu, 2023). Prime editing iki əsas komponentin inteqrasiyası yolu ilə əldə edilir: modifikasiya edilmiş CRISPR/Cas9 fermenti və tərs transkriptaza. CRISPR/Cas9 fermentinin rolu genomdakı dəqiq yerləri seçici şəkildə hədəfləməkdir, tərs transkriptaza isə hədəf yerdəki DNT-ni hərtərəfli modifikasiya etməyə kömək edir (Hassan və b., 2021). Prime redaktə mexanizmində ilk addım bir primer redaktə bələdçisi RNT-nin (pegRNA) yaradılmasını əhatə edir (Standage-Beier və b., 2021). Hədəf DNT-də istənilən redaktə yerinə uyğun hədəf ardıcıllığını və RNT şablonunu ehtiva edir. Daha sonra pegRNA, bir primer redaktə nukleazası (PE2) ilə birlikdə hədəf hüceyrələrə daxil edilir. PE2, Cas9 fermentindən, tərs transkriptazadan və bir primer redaktə adapterindən ibarət bir birləşmə zülalıdır (Martín-Alonso və b., 2021). Hüceyrənin içərisində pegRNA və PE2 kompleksləri dəyişdirmək istədikləri spesifik DNT-ni axtarır. Cas9 fermenti DNT-ni kəsir və tək zəncirlərdən ibarət bir şablon yaradır (Choi və b., 2022). Tərs transkriptaza bu şablondan DNT-ni redaktəyə hazırlamaq üçün istifadə edir. DNT-ni kopyalamaqla yanaşı, RNT şablonunu redaktə etmək üçün təlimatlar da daxil edilir. Nəhayət, yeni yaradılmış DNT zəncirindən DNT-dəki qırılmanı bərpa etmək üçün şablon kimi istifadə olunur və nəticədə istənilən modifikasiyanı ehtiva edən dəyişdirilmiş DNT ardıcıllığı yaranır (Ochoa-Sanchez və b., 2021). Primer redaktə mexanizmləri genlərdə geniş yayılmış mutasiyalara səbəb ola bilər. Nöqtə mutasiyalarını, əlavələri, silinmələri və hətta gen dəyişdirmələrini hədəf ala bilər (Anzalone və b., 2019; Chen və Liu, 2023). Primer redaktə əvvəlki genom redaktə texnologiyalarına nisbətən bir sıra üstünlüklər təklif edir. Bunlara artan dəqiqlik, azaldılmış hədəfdən kənar təsirlər və DNT ikiqat zəncirli qırılmalara etibar etmədən DNT-ni redaktə etmək imkanı daxildir (Anzalone və b., 2020).
CRISPR/Cas9 texnologiyası əvvəlcə bakteriyaları plazmid transferindən və faq infeksiyasından qorumaq üçün hazırlanmış və daha sonra genom redaktə etmək üçün effektiv RNT əsaslı DNT hədəfləmə vasitəsi kimi yenidən istifadə edilmişdir (Jiang və Doudna, 2017). Bundan əlavə, CRISPR/Cas9 sisteminin müvafiq olaraq bakterial və arxeal genomların 50% və 87%-də mövcud olduğu bildirilmişdir (Ishino və b., 2018). CRISPR/Cas9, in vivo və in vitro rejimlərindən istifadə edərək hər hansı bir anormal genetik ardıcıllığın silinməsi, daxil edilməsi və korreksiyası üçün potensial bir vasitədir (Sabit və b., 2021). Bundan əlavə, CRISPR/Cas9, maraq hədəf genləri üçün spesifikliyinə görə adaptiv immun sisteminin bir hissəsi olduğu göstərilmişdir (Chen və Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 Cas9 və tək bir bələdçi RNT-dən (sgRNA) ibarətdir. Cas9 çoxsaylı zülal komponentlərindən ibarət endonükleazadır. Bundan əlavə, Cas9 iki paydan ibarət olduğu üçün unikal struktur və konformasiya xüsusiyyətlərinə malikdir (Pacesa və b., 2022). REC payı daha sonra üç bölgəyə bölünür: REC1, REC2 və körpü spiralları (Cromwell və b., 2018). NUC üç paydan, yəni RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH və protospacer bitişik motiv (PAM) qarşılıqlı təsir domenindən ibarətdir (Şəkil 1) (Song və b., 2016). sgRNA iki komponentdən ibarətdir, o cümlədən CRISPR RNT (crRNA) və transkodlaşdıran kiçik RNT (izləyici RNT) (Şəkil 1). sgRNA, Cas9 zülalını konneksinlərə birləşdirərək effektiv kompleks əmələ gətirir, bu da effektor kompleksi kimi də tanınır (Richter və b., 2012). crRNA hədəf DNT ardıcıllıqlarının tanınmasında mühüm rol oynayan 18-20 nukleotid əsas cütüdür. Bundan əlavə, crRNA hədəf DNT ilə cütləşir və tracrRNA Cas9 nukleazasının hədəf DNT-yə bağlanması üçün bir iskele rolunu oynayır (Manghwar və b., 2019). Digər tərəfdən, PAM ardıcıllığında effektor kompleksinin DNT-yə bağlanmasını təsdiqləyən, müəyyən edən və vasitəçilik edən 3 nukleotid var. Cas9 zülal kompleksi alt vahidləri RuvC və HNH katalitik aktivliyə malikdir (Richter və b., 2012; Asmamaw və Zawdie, 2021). Cas9 alt vahidinin HNH nukleaza domeni crRNA ilə əlaqəli DNT zəncirini parçalayır. RuvC nukleaz domeni digər DNT zəncirlərini parçalayır və ikiqat zəncirli qırılmalar (DSB) yaradır, bundan sonra iki fərqli DNT qırılma təmir mexanizmi aktivləşir (Jiang və Doudna, 2017) (Şəkil 1).
Şəkil 1. CRISPR/Cas9-a ümumi baxış (A). CRISPR/Cas9 sisteminin komponentləri: (i). Cas9 endonükleazası hədəf DNT ardıcıllığının kəsilməsindən, (ii) crRNA və tra-crRNA ximerlərinin birləşməsindən yaranan tək bir bələdçi (sg) RNT-dən məsuldur. (iki). Cas9, Rec I, Rec II, NUC lobu (HNH və Ruv C alt komponentlərdir) və PAM qarşılıqlı təsir domeni (C) kimi uyğun funksiyaları olan bir neçə komponentdən ibarətdir. CRISPR/Cas9 zülal kompleksi DNT ardıcıllıqlarını qeyri-komplementar və tamamlayıcı formalara ayırır (D). CRISPR/Cas9 genomu üç mərhələdə redaktə edir: tanıma, kəsmə və təmir. Dizayn edilmiş sg-RNT Cas9-u istiqamətləndirir və tamamlayıcı komponent crRNA vasitəsilə istədiyiniz ardıcıllığı tanıyır. Cas9 PAM ardıcıllığını 5′-NGG-3′-da tanıyır və DNT-ni əridir, DNT-RNT hibridini əmələ gətirir və parçalanmanı aktivləşdirir. Cas9-un HNH domeni tamamlayıcı zənciri, RuvC domeni isə tamamlayıcı olmayan zənciri parçalayır. CRISPR/Cas9, dsDNT-ni iki yolla parçalayaraq bərpa edir: homoloji olmayan uc birləşmə (NHEJ) və homologiya yönümlü təmir (HDR). NHEJ, təsadüfi DNT ardıcıllıqlarını daxil edə və ya çıxara bilən xətaya meylli bir mexanizm olan fermentativ proses vasitəsilə xarici homoloji DNT olmadığı təqdirdə ikiqat zəncirli DNT-ni bərpa edir. HDR çox spesifikdir və homoloji DNT şablonları tələb edir.
CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə təmir yollarına homoloji olmayan son birləşmə (NHEJ) və homologiya yönümlü təmir (HDR) mexanizmləri daxildir. NHEJ, daxiletmə və ya silməni əhatə etdiyi və təmir mexanizmi zamanı heç bir nümunə tələb etmədiyi üçün xətaya meylli bir yoldur. Standart zülallar yaratmaq üçün təsadüfi nukleotidlərdən istifadə edir (Abbasi və b., 2021). Bu təmir sistemi KU kompleksi, çarpaz tamamlayıcı protein kompleksi tip 4 (XRCC-4), DNT son emal fermenti və protein kinaz DNT-PKcs kimi dörd kompleksdən ibarətdir (Abbasi və b., 2021). KU kompleks zülalının iki alt vahidi var: Ku 70 və Ku 80 və NHEJ mexanizmində mühüm rol oynayır, çünki bərpa mexanizmi iki alt vahidin (Ku 70 və Ku 80) hədəf DNT-nin küt və ya demək olar ki, küt uclarına bağlanması ilə başlayır (Abbasi və b., 2021) və zədələnmə yerinə digər NHEJ ilə əlaqəli amilləri cəlb etmək üçün bir iskele rolunu oynayır (Yang və b., 2020). XRCC-4 və DNT liqazası müvafiq olaraq 334 və 911 amin turşusundan ibarətdir və XRCC4-DNT liqaza IV kompleksi DNT uclarının bağlanmasını stimullaşdırır (Chatterjee və b., 2015). Polinukleotid kinaz 3′-fosfat kimi də tanınan DNT son emal fermenti DNT son emal fermentidir. DSB təmiri zamanı DNT-dəki 3′P qrupunu çıxara və 5′OH qrupunu fosforlaşdıra bilər. Bu, həmçinin SSB təmir yolundan istifadə edərək tək zəncirli fasilələrin (SSB) bərpasını da əhatə edir (Chatterjee və b., 2015). Protein kinaz DNT-PKcs, PIKK-ların (fosfatidilinozitol 3-kinazla əlaqəli kinazlar) və mutasiya olunmuş ataksiya telangiektaziya (ATM) ailəsinin katalitik alt vahidindən, eləcə də ATM və Rad3 ilə əlaqəli ATR-lərdən ibarət olan DNT-dən asılı protein kinazdır. Zəncirli fasilələr (DSB) və tək zəncirli fasilələr (Yue və b., 2020; Peng və b., 2016).
HDR daha dəqiq və uyğun bir təmir mexanizmidir, çünki məlumat homoloji DNT dupleksinin bütöv formasından istifadə edilərək kopyalanır, baxmayaraq ki, bu, bacı xromatidlərinin mövcudluğunu tələb edir. Bu, məməli hüceyrə dövrünün S/G2 mərhələsində baş verir. HDR əsasən maya növlərində baş verir, lakin NHEJ məməlilərdə çox vacibdir (Burma və b., 2006; Abbasi və b., 2021). Tam təmir mexanizmi Şəkil 1-də göstərilmişdir.
TNBC genetik və epigenetik anomaliyalardan qaynaqlandığı üçün CRISPR/Cas9 istifadə edərək bədxassəli genomik/epigenomik anomaliyaların korreksiyası ağlabatan terapevtik yanaşma ola bilər (Chen və b., 2019). Bundan əlavə, hüceyrəyə xas transkripsiya tənzimlənməsində iştirak edən bəzi transkripsiya amilləri xərçəng hüceyrələrinin unikal xüsusiyyətlərini nümayiş etdirə bilər ki, bu da transkripsiya tənzimlənməsinin xərçəng müalicəsi üçün əla bir yanaşma ola biləcəyini göstərir (Drost və b., 2017). Dərman inkişafı üçün şişlərin bu molekulyar xüsusiyyətlərindən, məsələn, genetik, epigenetik və transkripsiya qüsurlarından istifadə etmək klinik nəticələri yaxşılaşdıra və müayinə xərclərini azalda bilər. CRISPR, yalnız xərçəngə səbəb olan genom hədəflərini aşkarlaya və müəyyən edə bilməyən, həm də insan hüceyrələrində onkogenləri redaktə etmək, yatırmaq və epigenetik olaraq dəyişdirmək üçün istifadə edilə bilən potensial bir gen redaktə vasitəsidir (Cədvəl 1) (Əhməd və b., 2021). Şiş basqılayıcıları, onkogenləri və dərman müqaviməti ilə əlaqəli genləri axtarmaq üçün bir neçə CRISPR müayinəsi aparılmışdır. Müxtəlif TNBC onkogenlərini redaktə etmək üçün CRISPR/Cas9-un istifadəsi Şəkil 2-də göstərilmişdir.
Şəkil 2. CRISPR/Cas9 istifadə edərək müxtəlif TNBC onkogenlərinin gen redaktə edilməsi, nəticədə şiş böyüməsi və metastazı azalır. Bu onkogenlərə TNBC-nin baş verməsi və metastazında iştirak edən CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 və CXCR7, Crypto1, ROR1 və ST8SIA daxildir.
Xərçəng hüceyrələrinin miqrasiyası, invaziyası və epitelial-mezenximal keçid (EMT) ITGA9 ilə əlaqələndirilir. Əvvəlki tədqiqatlar göstərir ki, ITGA9 Notch yolunda əsas rol oynayır və rabdomiosarkoma metastazında maraqlı rol oynayır (Molist və b., 2020). Bundan əlavə, ITGA9-un döş xərçəngi də daxil olmaqla bir neçə şiş növündə xəstə proqnozu ilə sıx əlaqəli olduğu aşkar edilmişdir (Wang Z. və b., 2019). Bundan əlavə, ITGA9-un bioinformatik təhlili göstərdi ki, onun TNBC-də ifadəsi digər döş xərçəngi alt növlərinə nisbətən xeyli yüksəkdir. ITGA9 səviyyələrinin yüksəlməsi TNBC xəstələrində şiş metastazı və residivi ilə əlaqələndirilir. ITGA9-un CRISPR/Cas9 tərəfindən nokaut edilməsi xərçəng kök hüceyrəsinə (CSC) bənzər xüsusiyyətlərə, şiş angiogenezi, şiş böyüməsinə və TNBC-də β-katenin parçalanmasını təşviq etməklə metastazın azalmasına səbəb oldu (Wang Z. və b., 2019).
Kripto-1 TGF-β ailəsinin üzvüdür və erkən embriogenez, kök hüceyrələrinin qorunması və xərçəng metastazı üçün vacibdir (Ishii və b., 2021). Tdgf-1 kimi də tanınan bu zülal, ibtidai zolağın, mezodermanın və endodermanın əmələ gəlməsinin tənzimlənməsində, eləcə də embriogenez zamanı bədən orqanlarının inkişafında sol/sağ asimmetriyanın qurulmasında iştirak edən onkogen GPI-lövhəli siqnal zülalıdır (Zhang və b., 2021b). Bundan əlavə, Kripto-1-in kök hüceyrə marker kimi epitelial-mezenximal keçiddə (EMT) iştirak etdiyi göstərilmişdir (Zhang və b., 2021b). EMT yalnız embrional inkişaf, fibroz və yaraların sağalması kimi müxtəlif proseslər üçün deyil, həm də xərçəng invaziyası və metastazı üçün vacibdir. Bundan əlavə, Kripto-1-in dörd Notch reseptoru ilə qarşılıqlı təsir göstərdiyi və onların translyasiya sonrası yetkinləşməsini artırdığı göstərilmişdir (Brandstadter və Maillard, 2019). Notch siqnal yolunun insan döş xərçəngi hüceyrələrinin qorunmasında iştirak etdiyi məlumdur. Tədqiqatlar göstərir ki, Crypto-1-in CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə nokaut edilməsi xərçəngin böyüməsini və metastazını yatırır. Buna görə də, Crypto-1 TNBC üçün vacib terapevtik hədəfə çevrilə bilər (Castro və digərləri, 2015).
XCL12 zülalı və onun kemokin reseptoru CXC (CXCR4 və CXCR7) xərçəng hüceyrələrinin çoxalmasında, böyüməsində, miqrasiyasında və invaziyasında müxtəlif rol oynayır (Wu və b., 2015). Bu kemoreseptorlar həm in vivo, həm də in vitro modellərində çoxsaylı siqnal yolları vasitəsilə TNBC-nin inkişafı ilə əlaqələndirilmişdir (Wu və b., 2015). Bundan əlavə, CXCR4 və CXCR7-nin aktivləşməsi TNBC-də metastaza daha çox həssaslıq və zəif proqnozla əlaqələndirilir (Karn və b., 2022). Buna görə də, CXCR4 və CXCR7-nin nokaut edilməsi TNBC də daxil olmaqla döş xərçənginin müalicəsi üçün təsirli dərman hədəf genlərinə çevrilə bilər. Yang və b. tərəfindən aparılan tədqiqat. Yang və b. (2019) CXCR4 və CXCR7 genlərini birgə nokaut etmək üçün CRISPR/Cas9-dan istifadə etmiş və TNBC-nin çoxalmasının, böyüməsinin, miqrasiyasının və invaziyasının əhəmiyyətli dərəcədə inhibə edildiyini aşkar etmişdir (Yang və b., 2019).
Döş xərçəngi toxumalarında TNBC onkogeni olan miR-3662 səviyyəsinin artması müşahidə edilmişdir (Yi və b., 2022). miR-3662-nin susdurulmasının həm in vivo, həm də in vitro döş xərçəngi şişinin böyüməsini və metastazını maneə törətdiyi göstərilmişdir (Agarwal və Gupta, 2021). HBP-1 Wnt/-catenin siqnalının güclü bir inhibitorudur və çox güman ki, TNBC hüceyrələrinin miR-3662 vasitəçiliyi ilə böyüməsindən məsuldur. Bu yaxınlarda Yi və b. miR-3662-HBP1 oxunun TNBC hüceyrələrində Wnt/-catenin siqnal yolunu tənzimlədiyini aşkar etdilər (Yi və b., 2022). Şişə xas ifadəsinə görə miR-3662 TNBC üçün potensial terapevtik hədəf ola bilər. Beləliklə, miR-3662-nin CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə susdurulması TNBC-nin müalicəsi üçün yeni dərmanların hazırlanması üçün əla bir yanaşma ola bilər.
UBR5, müxtəlif xərçənglərdə şiş əmələ gəlməsinin, metastazın və immun reaksiyasının əsas tənzimləyicisi kimi müəyyən edilmiş 300 kDa nukleofosfoproteindir (Shearer və b., 2015; Fu və b., 2023). UBR5-in TNBC nümunələrində yüksək dərəcədə tənzimləndiyi və ubiquitin ligaz aktivliyi vasitəsilə proliferasiyanı stimullaşdırdığı bildirilir (Bolt və b., 2015). İlkin TNBC nümunələrinin bütün ekzom ardıcıllıq tədqiqatları da UBR5-in artan ifadəsini göstərdi ki, bu da onun TNBC-nin inkişafındakı rolunu göstərir. Bundan əlavə, UBR5-in CRISPR/Cas9 ilə idarə olunan silinməsi eksperimental siçan modellərində TNBC metastazının və böyüməsinin əhəmiyyətli dərəcədə inhibə olunduğunu göstərdi. Bundan əlavə, UBR5-in vəhşi tipli siçan modelinə daxil edilməsi onun tam funksionallığını bərpa etdi, halbuki bu təsir inaktivləşdirilmiş mutant ştammlarda müşahidə edilmədi (Liao və b., 2017). UBR5-in olmaması, zəif angiogenez səbəbindən TNBC-də apoptozun, nekrozun və şiş böyüməsinin inhibə edilməsinin artması ilə əlaqələndirilir. UBR5-in itirilməsi səbəbindən şişin uzaq orqanlara yayılması azalır və UBR5 əsasən E-kadherin ifadəsini azaltmaqla anormal EMT-yə səbəb olur (Zhang və Weinberg, 2018). Bu yaxınlarda UBR5-in E3 ubikvitinasiya aktivliyinin olmaması səbəbindən TNBC-də IFN-γ ilə induksiya edilmiş PDL1 transkripsiyasında çox vacib bir amil olduğu göstərilmişdir. RNT transkriptom analizi göstərdi ki, UBR5 IFN-γ yolu ilə əlaqəli genlərə sistemli təsir göstərə bilər və protein kinaz RNT-nin (PKR) və onun siqnal ötürücülərinin və aktivatorlarının aktivləşmə səviyyələrini artıraraq PDL1 transaktivasiyasını təşviq edə bilər. transkripsiya 1 (STAT1) və interferon tənzimləyici faktor 1 (IRF1). Lakin, UBR5 və PD-L1 ifadəsinin CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə birləşdirilmiş ablasiyasının hər iki blokadadan fərqli olaraq sinergetik terapevtik təsiri var və şiş mikro mühitinə dərin təsir göstərir (Wu və b., 2022). Beləliklə, CRISPR/Cas9 UBR5 funksiyasını inhibə etmək və bununla da TNBC metastazını və şiş böyüməsini yatırmaq üçün vacib bir vasitə ola bilər.
ROR1, xərçəng və embrional inkişaf zamanı ifadə olunan və onkofetal zülal kimi müəyyən edilmiş I tip transmembran zülaldır (Nicholas Borcherding, 2014). Müxtəlif insan xərçənglərinin invaziv davranışı ROR1-in yüksəlməsi ilə əlaqələndirilir. ROR1-i hədəf alan terapevtik birləşmələri əhatə edən in vivo və in vitro tədqiqatlarından ümidverici nəticələr əldə edilmişdir (Chien və b., 2016). Döş toxuması biopsiyalarında ROR1 mRNT-nin yüksək səviyyələri də aqressiv bazal bənzər döş (BL) şişləri və onların bədənin digər hissələrinə miqrasiyası ilə əlaqələndirilmişdir. Bundan əlavə, ROR1-in həddindən artıq ifadəsi TNBC-nin inkişafı üçün proqnostik marker kimi müəyyən edilmişdir (Chien və b., 2016). Bununla belə, TNBC böyüməsini və metastazını yatırmaq üçün CRISPR/Cas9 istifadə edərək ROR1-i susdurmaq təsirli bir strategiya olardı.
Sialilləşmə prosesi sial turşusunun qlikokonjugatlara əlavə edilməsini əhatə edir ki, bu da sialiltransferazalar (ST) tərəfindən katalizləşdirilir. ST8SIA1 ST ailəsinə aiddir və limfositik lösemi və kolorektal xərçəng kimi müxtəlif xəstəliklərin patogenezində mühüm rol oynayır (Chang və b., 2018). RNT ardıcıllığı təhlili göstərir ki, ST8SIA1 TNBC xəstələrinin döş toxumasında yüksək dərəcədə ifadə olunur və şiş basqılayıcı gen p53-dəki mutasiyalarla müsbət korrelyasiya olunur ki, bu da TNBC-nin patogenezinə töhfə verə bilər (Battula və b., 2017). Bundan əlavə, ST8SIA1 TNBC-nin metastazında və təkrarlanmasında iştirak edir ki, bu da onun TNBC-nin yaranmasında və inkişafında mühüm rol oynadığını göstərir. TNBC-nin in vitro modelində CRIPSR/Cas9 tərəfindən ST8SIA1-in susdurulmasının böyüməni və metastazı blokladığı göstərilmişdir (Battula və b., 2017). Bu, CRISPR/Cas9-un TNBC müalicəsində ST8SIA1 onkogeninin funksiyasını inhibə etmək üçün vacib bir vasitə ola biləcəyini göstərir.
NAT1, II fazalı ksenobiotik birləşmələrin əmələ gəlməsini katalizləşdirən və demək olar ki, bütün insan toxumalarında ifadə olunan metabolik bir fermentdir. NAT1, aromatik amin substratı olmadıqda belə, asetil-KoA-nı (asetil-KoA) hədəf almaq üçün kofaktor folatdan istifadə edə bilər (Stepp və b., 2015; Laurieri və b., 2014). Tədqiqatlar göstərir ki, NAT1 döş xərçəngi hüceyrə modellərində matrix metalloproteinaza 9 (MMP9) funksiyasını tənzimləyir və qlükoza aclığı zamanı reaktiv oksigen növlərinə (ROS) qarşı qoruyur (Wang və b., 2018). NAT1-in silinməsinin piruvat dehidrogenaza kompleksini inhibə etdiyi və mitoxondrial disfunksiyaya səbəb olduğu göstərilmişdir (Wang L. və b., 2019). Bundan əlavə, müxtəlif digər hesabatlar göstərir ki, kiçik molekullar və siRNA-nın susdurulması istifadə edərək NAT1 inhibisiyası döş xərçəngi hüceyrələrinin invazivliyini və proliferasiyasını azalda bilər (Stepp və b., 2018). Bu yaxınlarda, CRISPR/Cas9, ifadə səviyyəsindən asılı olaraq hüceyrə metabolizmasına təsir edən MDA-MB-231 döş xərçəngi hüceyrə xəttində NAT1-i basdırmaq üçün istifadə edilmişdir. Bu tədqiqat həmçinin NAT-1-in TNBC-nin irəliləməsi və metastazı üçün vacib olduğunu göstərdi (Carlisle və digərləri, 2020).
Onkogenlərin əlaqələndirilmiş transkripsiyası super gücləndiricilər, transkripsiya amilləri və kofaktorlar tərəfindən tənzimlənir (Hnisz və b., 2015). Bundan əlavə, transkripsiya tənzimlənməsi üçün CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 və CDK13 kimi bir qrup siklin asılı kinazlar (CDK) tələb olunur. Bunların arasında CDK7, TNBC patogenezində onkogen transkripsiyasının başlanması və genişlənməsi üçün çox vacib olan RNT polimeraz II-nin fosforlaşmasında iştirak edir. Əsas bir tədqiqatda, CRISPR/Cas9 tərəfindən CDK7-nin silinməsi TNBC-ni inhibə etdi və bu da TNBC patogenezinin CDK7-dən asılı olduğunu göstərir (Wang Y. və b., 2015).
Tədqiqatlar göstərir ki, MYC və RBP-dəki (RNT bağlayan zülal) mutasiyalar apoptoza səbəb ola bilər, MYC və ya RBP-dəki tək gen mutasiyaları isə xərçəng hüceyrələrinin böyüməsinə təsir göstərmir (Einstein və b., 2021). İnsan genomundakı 1000-dən çox RBP CRISPR/Cas9 əsaslı kitabxana istifadə edilərək yoxlanılıb. Bunlardan 57 RBP-nin yüksək MYC səviyyələrinə malik xərçəng hüceyrələrinin böyüməsi üçün kritik olduğu aşkar edilib (Wheeler və b., 2020). Bundan əlavə, YTHDF2 TNBC hüceyrə böyüməsini qorumaq üçün vacibdir və daha yüksək MYC ifadəsinə malik xərçəng hüceyrələrində yüksək səviyyəli transkripsiya və tərcümə zamanı metil transkriptlərin miqdarını azaldır. Bundan əlavə, YTHDF2 TNBC xəstələrinin sağ qalmasını uzatmaq üçün yüksək MYC səviyyələrindən daha az asılı olan xərçəng hüceyrələri üçün vacib deyil (Einstein və b., 2021), bu da onun TNBC-ni dəf edə bilən dərmanlar üçün potensial terapevtik hədəf ola biləcəyini göstərir.
Sink barmaq zülalları (ZNF) ümumi insan genomunun təxminən 1%-ni təşkil edir. Tədqiqatlar göstərir ki, ZNF qaraciyər xərçəngi, döş xərçəngi və kolorektal xərçəng kimi müxtəlif xərçəng növlərində hüceyrə proliferasiyasını tənzimləyə bilər (Zhang W. və b., 2021; Li və b., 2017). CRISPR nokautu ilə yaradılan kitabxanalar döş xərçəngi hüceyrələrində müxtəlif şiş basqılayıcı genləri (TSG) skrininq etmək üçün istifadə edilmişdir (Shalem və b., 2014). O vaxtdan bəri, CRISPR/Cas9 ZNF319 tərəfindən silinmiş döş xərçəngi hüceyrələrinin transkriptomik tədqiqatı göstərdi ki, ZNF319 döş xərçəngi proliferasiyasını azaldan və buna görə də müxtəlif potensial siqnal mexanizmlərində və digər bioloji funksiyalarda iştirak edən bir şiş basqılayıcı genidir (Wang L. və b., 2022).
Ferroptoz, dəmirin mövcudluğundan asılı olan proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümünün bir növüdür. Ferroptozun inkişafına lipid peroksidlərinin mövcudluğundan təsirləndiyi məlumdur. Bundan əlavə, PKCβII-nin erkən lipid peroksidləşməsini nümayiş etdirdiyi və artan lipid peroksidləşməsinin ferroptozla əlaqəli olduğu bildirilir. CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə kinaz inhibitorlarının kitabxanasının müayinəsi PKCβII-nin MDA-MB-231 hüceyrələrində ferroptoz üçün vacib olan lipid peroksidləşməsi prosesində iştirak etdiyini aşkar etdi (Zhang və b., 2022). Buna görə də, bu, CRISPR/Cas9 tərəfindən PKCβII-nin nokaut edilməsinin ferroptozla əlaqəli xəstəliklərin müalicəsi üçün potensial şiş basqılayıcı gen hədəfi ola biləcəyini göstərir (Zhang və b., 2022).
Dərman müqavimətinin xərçəng xəstələrində ölümlərin təxminən 90%-nin səbəbi olduğuna inanılır və xərçəng müalicəsində əsas çətinliklərdən biridir (Bukowski və b., 2020). Nəticələr göstərir ki, dərman axını, DNT təmiri, apoptoz və müxtəlif hüceyrə siqnal yolları ilə əlaqəli kifayət qədər gen dərman müqaviməti ilə əlaqələndirilir (Haider və b., 2020). Bunların arasında bir neçə gen CRISPR/Cas9 alətləri tərəfindən hədəfə alınıb və dərman müqavimətinin azaldılmasında və xərçəng əleyhinə müalicələrin effektivliyinin artırılmasında ümidverici nəticələr göstərib (Vaghari-Tabari və b., 2022). Bundan əlavə, yüksək məhsuldarlıqlı CRISPR/Cas9 gen nokaut skrininq kitabxanaları potensial dərman müqaviməti gen hədəflərinin funksiyasını dəyişdirməkdə iştirak edib (Shalem və b., 2015). Paklitaksel müqavimət genlərini müəyyən etmək üçün, təkrarlanan TNBC xəstələrində dərman müqaviməti ilə əlaqəli olan histon deasetilaza 9 (HDAC9) daxil olmaqla səkkiz namizəd gen müəyyən etmək üçün genom genişliyindəki sgRNA kitabxanası skrininqi ilə birləşdirilmiş RNT ardıcıllığı istifadə edilmişdir (B və b., 2020). Başqa bir tədqiqatda, xərçəng əleyhinə dərmanlarla müalicə olunan TNBC xəstələrinin sağ qalması zamanı diserin/treonin və tirozin protein kinazının (DSTYK) artan ifadəsi müşahidə edilmişdir. Bundan əlavə, DSTYK-nin CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə nokdaun edilməsi dərmana davamlı xərçəng hüceyrələrinin in vitro (SUM102PT hüceyrələri və MDA-MB-468 hüceyrələri) apoptozunu və in vivo TNBC modelini əhəmiyyətli dərəcədə artırmışdır (Ogbu və b., 2021).
TNBC-də MAPK yolunun anormal aktivləşməsinə baxmayaraq, MEK-hədəfli terapiyaların klinik təsiri zəifdir. CRISPR/Cas9 genom kitabxanası müayinəsi göstərdi ki, PSMG2-nin (proteom yığımı şaperonu 2) inhibisiyası TNBC BT549 və MB468 hüceyrələrini MEK inhibitoru AZD6244-ə qarşı həssaslaşdırır. PSMG2-nin CRISPR/Cas9-da nokdaun edilməsi normal proteasom funksiyasını dəyişdirdi və bu da PDPK1-in autofagiya vasitəçiliyi ilə parçalanmasına səbəb oldu və bununla da AZD6244 (MEK inhibitoru) və MG132 (proteasom inhibitoru) tərəfindən induksiya edilən TNBC siçan modellərində şiş hüceyrələrini daha da yaxşılaşdırdı. Beləliklə, şiş hüceyrələrinin proliferasiyasını azaltmaq üçün proteasom və MAP kinaz (MEK) inhibitorları sinergetik şəkildə tətbiq oluna bilər (Wang X. və b., 2022).
CRISPR/Cas9 həmçinin TNBC müqavimətinə gətirib çıxaran gen funksiyasının itirilməsini yoxlamaq üçün də istifadə edilmişdir (Shu və b., 2020). Ge və b. TNBC-də BET bromodomain inhibitoru (BBDI) olan JQ1 ilə müalicə olunan xərçəng hüceyrələrinin dərman müqavimət mexanizmini izah etdilər. CRISPR/Cas9-dan istifadə edərək, onlar rb1 geninin silinməsinin TNBC-nin xərçəng əleyhinə dərman JQ1-ə qarşı müqavimət göstərməsinə səbəb olduğunu aşkar etdilər. Buna görə də, rb1 funksiyası TNBC-də JQ1 dərmanlarına cavabda vacibdir. Onlar həmçinin paklitakselin CDK4/6 kinaz/mikrotübül inhibitoru olduğunu və onun JQ1 kimi BBDI-lərlə kombinasiyasının dərmana davamlı TNBC-yə ümidverici terapevtik cavablar verə biləcəyini bildirdilər (Ge və b., 2020).
Uzun kodlaşdırmayan RNT-nin (lncRNA) transkripsiya mənzərəsinin TNBC-də neoadjuvant terapiyaya müqavimətdən məsul olduğu bildirilmişdir. Bu tədqiqat göstərir ki, beş fərqli MALAT1 lncRNA transkripti TNBC-də yüksək dərəcədə ifadə olunur. Bundan əlavə, MALAT1-in CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə silinməsi TNBC BT-549 hüceyrələrinin paklitakselə və doksorubisinə qarşı həssaslığını artırdı ki, bu da TNBC-də MALAT1 müqavimətinin potensial rolunu göstərir (Shaath və digərləri, 2021).
BRCA1-də (BRCA1m) mutasiyalar heterojendir və buna görə də aşkarlanması çətindir. BRCA1-in sintetik ölümcül partnyoru olan PARP1-i (poli(ADP-riboza) polimeraz) hədəf almaq TNBC dərmanının kemosensitivliyini artıra bilər. CRISPR/Cas9 istifadə edərək, PARP1-in silinməsi doksorubisin, gemsitabin və dosetaksel kimi xərçəng əleyhinə dərmanların mBRCA1 mutant TNBC hüceyrələrinə həssaslığını artırdı və bu da PARP1-in TNBC-də dərman müqavimətində də iştirak etdiyini göstərir (Vaghari-Tabari və b., 2022). Şiş basqılayıcı genləri olan BRCA1 və ya BRCA2-dəki mutasiyaların insanlarda döş xərçəngi inkişaf ehtimalını artırdığı məlumdur. Bu xəstələrin müalicəsi PARP inhibitorlarının istifadəsini tələb edir. Bundan əlavə, CRISPR/Cas9 istifadə edərək nukleotid xilasetmə faktoru DNPH1-in nokaut edilməsinin zəhərli nukleotid 5-hidroksimetildeoksiuridin (hmdU) monofosfatı xaric edə biləcəyi və bununla da BRCA çatışmazlığı olan hüceyrələrin PARP inhibitorlarına həssaslığa qarşı reaksiyasını artırdığı nümayiş etdirilmişdir (Fugger). və b., 2021). Beləliklə, CRISPR/Cas9 və PARP1 inhibitorları TNBC üçün vacib bir müalicə strategiyasına çevrilə bilər.
Penetrant qlikoprotein (P-gp) geni, ümumiyyətlə bütün TNBC-lərin təxminən 41%-də yüksələn çoxdərmanlı müqavimət genidir (Sun və b., 2020). P-gp ilə induksiya edilən dərman axını döş xərçəngində dərman müqavimətinin əsas tənzimləyicisi kimi müəyyən edilmişdir. P-gp inhibitorları döş xərçəngində xərçəng əleyhinə dərmanlara qarşı artan həssaslıq nümayiş etdirmişdir (Famta və b., 2021). Beləliklə, CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə P-gp və P-gp inhibitorlarının ablasiyası və ya basdırılması TNBC-də dərman müqavimətini aradan qaldırmaq üçün çox vacib üsullar ola bilər.
ATP-bağlayıcı kaset daşıyıcısı G2 (ABCG2) TNBC-də dərman müqavimətinə səbəb olduğu məlumdur (Palasuberniam və b., 2015), baxmayaraq ki, hazırda CRISPR/Cas9 və ABCG2-nin susdurulması ilə şiş basqılayıcı geninin inaktivasiyası arasındakı əlaqəyə dair heç bir məlumat yoxdur. PTEN ABCG2 aktivləşməsini artıra bilər (Palasuberniam və b., 2015), (Deepak Singh və b., 2021). Buna görə də, ABCG2-ni çıxarmaq üçün CRISP/Ca9 istifadə etmək və onu ABCG2 inhibitoru ilə birləşdirmək TNBC-də dərman müqavimətini aradan qaldırmaq üçün uyğun bir müalicə ola bilər. Cədvəl 2-də bütün müqavimət genlərini hədəf alan CRISPR/Cas9-dan bəhs olunur.
Cədvəl 2. CRISPR/Cas9, hüceyrələri xərçəng əleyhinə dərmanlara həssaslaşdırmaq üçün müxtəlif TNBC müqavimət genlərini hədəf alır.
CRISPR/Cas9 kitabxanaları xərçəng patogenezi ilə əlaqəli gen mutasiyalarının skrininqi üçün potensial vasitələrdir (Chan və b., 2022). Bu skrininq metodu (a) kitabxana qurulması, (b) lentiviral transduksiya, (c) fenotipik skrininq və (d) hədəf gen analizi kimi dörd mərhələni əhatə edir. TNBC-də MAPK yolunun anormal aktivləşməsinə baxmayaraq, PTEN, RB1 və TP53 kimi şiş supressor genlərində mutasiyalar daşıyan TNBC xəstələri üçün MEK hədəf terapiyasının klinik proqnozu çox zəifdir.
Bundan əlavə, CRISPR/Cas9 istifadə edərək aparılan gen nokaut skrininqi, dehidrokatrolun MDA-MB-231 üzərindəki təsirini anlamaq üçün Qvatemala çiçək və yarpaq ekstraktlarında bol olan ən güclü və selektiv molekul olan dehidrokatrolu sınaqdan keçirdi. Selektiv hüceyrə sitotoksikliyinin mexanizmləri. TNBC alt tiplərinin mezenximal kök xüsusiyyətləri. Bu CRISPR/Cas9 əsaslı skrininq həmçinin 17β-hidroksisteroid dehidrogenaza tip 11-i kodlayan gen olan HSD17B11-in MDA-MB-231 hüceyrələrində yüksək dərəcədə ifadə olunduğunu və MDA-MB-231 hüceyrələri üçün spesifik dehidrofalkarinol ilə nəticələndiyini aşkar etdi (Grant və s., 2020). Beləliklə, bu, CRISPR/Cas9 genomik skrininqinin potensial təbii birləşmələrin xərçəng əleyhinə xüsusiyyətlərinin altında yatan mexanizmləri müəyyən etməkdə böyük potensiala malik olduğunu göstərir.
Bundan əlavə, TNBC-nin xərçəngə qarşı həssaslığı, onkogen və şiş basqılayıcı yolları arasında əlaqəni göstərən qərəzsiz genom üzrə in vivo CRISPR/Cas9 ekranından istifadə edilərək öyrənilmişdir. mTOR və Hippo yollarının əsas komponentlərinin TNBC-də şiş tənzimlənməsində mühüm rol oynadığı bildirilmişdir. Bundan əlavə, tədqiqatlar göstərir ki, mTORC1/2 və YAP onkoproteinin farmakoloji inhibisyonu in vitro dərman-matris sinergiya modeli və in vivo xəstədən əldə edilən ksenotransplantatlardan istifadə edərək TNBC-nin patogenliyini effektiv şəkildə inhibə edir. Bundan əlavə, Torin-1 vasitəçiliyi ilə mTORC1/2 inhibisyonu makropinositozu artırır, verteporfinlə induksiya edilən YAP inhibisyonu isə TNBC hüceyrə ölümünə səbəb olur. Ümumilikdə, bu nəticələr TNBC üçün yeni və effektiv müalicələri müəyyən etmək üçün genom üzrə in vivo CRISPR ekranlaşdırmasının gücünü və möhkəmliyini vurğulayır (Dai və b., 2021).
İmmun sisteminin pozulması şiş əmələ gəlməsində mühüm amildir. Xərçəng hüceyrələri müdafiə mexanizmlərini keçərək, o cümlədən şiş mikro mühitində immun hüceyrələrinin fəaliyyətinə müdaxilə edərək və immun sistemini təhlükə altına qoyaraq immun təmizlənməsindən yayınırlar. Buna görə də, təkmilləşdirilmiş immun sisteminin inkişaf etdirilməsi şişlərlə mübarizədə əsas yanaşma ola bilər. CRISPR/Cas9 əsaslı gen modifikasiyasının istifadəsi immun disfunksiyası ilə bağlı bir neçə məsələni müxtəlif perspektivlərdən həll edir. CRISPR/Cas9 aşağıdakı yollarla döş xərçənginə qarşı şiş əleyhinə immuniteti artırmaq üçün istifadə edilmişdir (Şəkil 3).
Şəkil 3. CRISPR/Cas9 immunoterapiyası TNBC hüceyrələrini hədəf alır. CDK5-in itirilməsi və PDL1 və CD155-in susdurulması immun sistemini gücləndirir. Eynilə, A2AR-ın itirilməsi və HER2, mucin 1 və TEM8 kimi TAA-ların susdurulması CAR-T hüceyrələrinin xərçəng hüceyrələrini öldürməkdəki səmərəliliyini artırdı. CRISPR/Cas9 ilə idarə olunan T hüceyrə skrininqi göstərdi ki, p38 kinazının pozulması T hüceyrələrinin şiş əleyhinə aktivliyini artırır. CRISPR/Cas9 tərəfindən modifikasiya edilmiş T hüceyrələri TCR (T hüceyrə reseptoru) ifadəsini artırır və nəticədə T hüceyrələri şiş əleyhinə aktivliyə malikdir.
İmmunoterapiyanın məqsədi immun sistemini xərçəng hüceyrələrinə hücum etməyə stimullaşdırmaqdır. İmmun yoxlama nöqtəsi zülallarının həddindən artıq ifadəsi adətən otoimmün reaksiyaların qarşısını alır, lakin xərçəngin onlardan qaçınmasına kömək edə bilər (Topalian və b., 2015). Bu zülallar immun hüceyrələrinin səthindəki reseptorlara bağlanaraq immun reaksiyalarının qarşısını alır. Çoxsaylı yoxlama nöqtəsi zülalları (məsələn, CD155 və PD-L1) immun hüceyrələrindəki PD-1 reseptorunu hədəf alır və döş xərçəngində, xüsusən də TNBC-də ifadə olunur (Li Y.-C. və b., 2020). CRISPR/Cas9 istifadə edərək PD-L1 və ya onun reseptorunun nakaut edilməsi immun sistemini TNBC şişlərinə hücum etməyə stimullaşdıra bilər (Yahata və b., 2019). Bundan əlavə, CDK5-in CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə silinməsi yolu ilə PD-L1 ifadəsinin aşağı tənzimlənməsinin in vitro və in vivo şiş böyüməsini maneə törətdiyi göstərilmişdir (Deng və b., 2020). Döş xərçənginin in vitro və in vivo modellərində böyümənin inhibə edilməsi, CD155-in shRNA vasitəçiliyi ilə azaldılmasının döş xərçənginə terapevtik təsir göstərə biləcəyini göstərir (Gao və digərləri, 2018).
CAR T hüceyrələri, şişlə əlaqəli antigenləri (TAA) tanıyan və aktivliyini artırmaq üçün nəzarət nöqtəsi zülallarının dekompozisiyasından istifadə edə bilən CAR-ları ifadə edir (Li C. və b., 2020). Döş xərçəngində CAR T hüceyrə terapiyası üçün müxtəlif potensial hədəflər mövcuddur, o cümlədən HER2, mucin1 və TEM8 kimi bir neçə TAA (Bajgain və b., 2018). Mezotelini hədəf alan CAR T hüceyrələrinin (TNBC BT-459 hüceyrələrində həddindən artıq ifadə olunmuş) CRISPR/Cas9 istifadə edərək PD-1 dekompozisiya edildikdə xərçəngə qarşı daha təsirli olduğuna dair dəlillər mövcuddur (Hu və b., 2019). Bununla belə, xəstələrdən T hüceyrələrini təcrid etmək və sonra onları ex vivo redaktə etmək əmək tələb edən və vaxt aparan bir prosesdir. Universal T hüceyrələri təcrid tələblərini azalda bilsə də, transplantasiya-sahib əleyhinə anomaliyaların qarşısını almaq üçün insan leykosit antigeni (HLA) I sinif və T hüceyrə reseptorunu (TCR) ifadə edən donor T hüceyrələri çıxarılmalıdır (Ren və b., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 istifadə edərək, HDR eyni zamanda TCR və HLA-nı aradan qaldıra və CAR-ı kodlayan geni məhv edə bilər. Tədqiqatlar göstərir ki, CRISPR/Cas9 anti-CD19 CAR-larını TCR lokusa daxil etmək və bununla da T hüceyrələrini tükəndirmədən CAR-ları səmərəli şəkildə istehsal etmək üçün istifadə edilə bilər (Dimitri və b., 2022). TNBC-yə qarşı daha yüksək xərçəng əleyhinə xüsusiyyətlərə malik ola biləcək TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), HLA-I alt vahidi və PD-1 və CTLA-4 kimi digər zülalları eyni vaxtda aradan qaldırmaqla allojenik CAR T hüceyrələri yaratmaq üçün multipleks texnologiyaları hazırlanmışdır (Eyquem və b., 2017; Liu və b., 2017; Ren və b., 2017b; Dimitri və b., 2022).
CRISPR/Cas9 istifadə CAR-T hüceyrələrinin effektivliyini artıra bilər. Adenozinin immunosupressiv xüsusiyyətlərə malik olduğu və T hüceyrə funksiyasını bloklamaqla və adenozin A2A reseptorlarını (A2AR) aktivləşdirməklə xərçəng əleyhinə immuniteti azalda biləcəyi məlumdur (Vigano və b., 2019). CRISPR/Cas9 istifadə edərək A2AR-ın susdurulması CAR-T hüceyrələrinin in vivo effektivliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Giuffrida və b., 2021). T hüceyrələrinin hüceyrə genişlənməsi, differensiasiyası, oksidləşdirici stress və genomik stress kimi müxtəlif fenotipik xüsusiyyətlər nümayiş etdirdiyi məlumdur. CRISPR/Cas9 əsaslı T hüceyrə skrininqi 25 fərqli T hüceyrə reseptor kinazının pozulmasını aşkar etdi. Bunların arasında p38 kinazın silinməsinin T hüceyrələrinin şiş əleyhinə aktivliyini artırdığı göstərilmişdir ki, bu da p38 kinazın CAR-T hüceyrə tənzimlənməsinin əsas tənzimləyicisi olduğunu göstərir (Gurusamy və b., 2020).
T hüceyrələri yüksək ifadə olunmuş TCR-lər istehsal etmək üçün CRISPR/Cas9 istifadə edərək genetik modifikasiya edilə bilər. Genetik modifikasiya olunmuş T hüceyrələrinin xəstələrə köçürülməsi endogen T hüceyrələrinə nisbətən daha güclü xərçəng əleyhinə aktivlik göstərmişdir. Buna görə də, endogen TCR-lər xəstələrdə genetik modifikasiya olunmuş TCR-lərlə rəqabət apara bilər ki, bu da xərçəng immunoterapiyasının potensialına təsir göstərə bilər. Bu problemi aradan qaldırmaq üçün CRISPR/Cas9 istifadə edərək resipient hüceyrələrindəki endogen TCR-β-nı çıxarmaq və sonradan TCR-β T hüceyrələrini xərçəng xəstələrinə ötürmək endogen TCR cinsi rəqabətinə ehtiyac olmadan daha yaxşı xərçəng əleyhinə immun reaksiyaları nümayiş etdirə bilər (Fan və b. 2018). Beləliklə, CRISPR ilə modifikasiya olunmuş T hüceyrələri istisna olmaqla, TCR-lər normal TCR ilə ötürülən T hüceyrələrinə nisbətən şiş antigenlərinə min dəfə daha həssasdırlar. Bundan əlavə, müxtəlif leykemiyalarda γδ TCR+ CRISPR tərəfindən yaradılan dəyişdirilmiş T hüceyrələri standart TCR ötürülməsinə nisbətən daha yüksək CD4+ və CD8+ T hüceyrələri ifadəsi nümayiş etdirir (Legut və b., 2018). Beləliklə, CRISPR/Cas9 tərəfindən yaradılan modifikasiya olunmuş T hüceyrələri TNBC-ni aradan qaldırmaq üçün təsirli bir immunoterapiya metodu ola bilər.
İnteqrinlər hüceyrə transmembranlarında mövcud olan və hüceyrələrin hüceyrədənkənar matrisə (ECM) bağlanmasını təşviq edən hüceyrə adgeziyası molekullarıdır (Hamidi və İvaska, 2018). İnteqrinlərin tənzimlənməsinin pozulması hüceyrədənkənar matrisi dəyişdirməklə xərçəngin inkişafı və miqrasiyası ilə əlaqələndirilir və bu da qan dövranında xərçəng hüceyrələrinin sağ qalmasına səbəb olur (Hamidi və İvaska, 2018). CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə inteqrin nokautu TNBC-də şişin irəliləməsini, metastazını və kolonizasiyasını yavaşlatır. İnteqrin a5-in (ITGA5) nokautunun ağciyər xərçəngi kimi digər xərçəng növlərində hüceyrə miqrasiyasını və irəliləməsini azaltdığı bildirilir (Ju və digərləri, 2017), bu da inteqrin a5-in də TNBC-nin patogenezində əsas amil ola biləcəyini göstərir.
Ənənəvi embrion kök (ES) hüceyrə metodlarından istifadə edərək nokaut siçanların yaradılması əmək tələb edən, vaxt aparan və səmərəsiz bir prosesdir. Homoloji rekombinasiya yolu ilə ES hüceyrələrini hədəf almaq, ximer siçanları yetişdirmək və sonra homoziqot nəsillər yaratmaq üçün onları heteroziqot siçanlarla çarpazlaşdırmaq aylar və illər çəkir. Çoxsaylı genetik mutasiyalara malik siçanların yaradılması üçün mürəkkəb çarpazlaşdırma tələb olunur. Bununla belə, CRISPR/Cas9 istifadə edərək ES hüceyrələrinin ablasiya edilməsi və ya CRISPR/Cas9 komponentlərinin tək hüceyrəli mayalanmış yumurtalara mikroinjeksiya yolu ilə yaradılan siçanlardan istifadə edərkən bir çox problem yaranmışdır. Məsələn, dəyişikliklərin daxil edilməsi çox vaxt biallel lokuslarda baş verir və gen spesifik deyil. Bu yaxınlarda CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə edən ES hüceyrələrinin eyni vaxtda 5 genə qədər biallel mutasiyalar daxil edə biləcəyi bildirilmişdir (Nishizono və b., 2021). Bu məqsədlə Cas9 mRNT və beş genə spesifik gRNT eyni vaxtda ES hüceyrələrinə transfeksiya edilmişdir. Bu, bu prosedurun vədini və effektivliyini vurğulayır, baxmayaraq ki, bu mutasiyalar beşqat nokaut siçanları istehsal etmək üçün qurucu xətləri yetişdirildikdə ötürülmüş ola bilər. Tədqiqat həmçinin təəccüblü bir kəşfi bildirir: ES hüceyrələrinə artıq genetik modifikasiya olunmuş siçanların yaradılması tələb olunmur. Bunun əvəzinə, müəyyən gen məhsullarını çıxarmaq üçün Cas9 mRNA və gRNA tək hüceyrəli mərhələli embrionlara yeridildi. Nəticədə, nəzəri olaraq siçanlarda gen silinməsinin nəticələrini öyrənmək üçün istifadə edilə bilən nokaut qurucu xətləri yaradıldı (Qin və b., 2016). Beləliklə, CRISPR/Cas9, TNBC-ni ənənəvi gen mühəndisliyindən daha aşağı qiymətə müalicə etmək üçün transgen siçanların yaradılmasına imkan verir. CRISPR/Cas sistemindən istifadə edərək, TNBC-də bir və ya daha çox endogen gendə nöqtə mutasiyalarını uğurla tətbiq edə bilən yeni bir nokaut siçan modeli hazırlanmışdır. Bu konsepsiyaya əsasən, TNBC-nin heyvan modelləri də BRCA1 və p53-ün CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə silinməsindən istifadə etməklə inkişaf etdirilə bilər ki, bu da ürək ritminin bərpasının itirilməsinə, genomik qeyri-sabitliyə və mutant fenotiplərə səbəb olur (Annunziato və digərləri, 2020).
Hazırda mammoqrafiya, maqnit rezonans görüntüləmə (MRT) və ultrasəs kimi müxtəlif üsullar TNBC diaqnozu qoymaq üçün istifadə olunur. Lakin bu üsulların bəzi məhdudiyyətləri var. Mammoqrafiya xərçəng hüceyrələrinin digər orqanlara köçdüyü metastazlar əvəzinə yerli döş toxumasını diaqnoz etmək üçün istifadə olunur. Ultrasəs müayinəsi TNBC diaqnozu qoymaq üçün etibarlı bir üsul deyil (Chen və Lee-Felker, 2023). MRT ultrasəs və mammoqrafiyadan daha yüksək həssaslığa malikdir, lakin diaqnostik dəqiqliyi məhduddur (Sha və Chen, 2022). Toxuma biopsiyası xərçəng hüceyrələrini müəyyən etmək üçün invaziv bir yoldur. Lakin, bəzi hallarda, iynə maraq dairəsindən kənara çıxarsa, biopsiya xərçəng toxumasını qaçıra bilər. Bundan əlavə, bu, çox bahalıdır və xəstə üçün travmatik ola bilər. TNBC heterojen bir xərçəng növüdür, buna görə də biopsiya xərçəng növü haqqında kifayət qədər məlumat verməyə bilər. Buna görə də, TNBC-ni aşkar etmək üçün yeni diaqnostik cəhətdən etibarlı bir üsula təcili ehtiyac var. CRISPR/Cas9 döş xərçəngi diaqnozu üçün yüksək həssas və minimal invaziv alternativ kimi xidmət edə bilər. Bu məqsədlə, TNBC diaqnozu üçün PCR metodlarını təkmilləşdirmək üçün CRISPR/Cas9 əsaslı strategiyalardan istifadə etmək olar. Əvvəlcə CRISPR sisteminin Cas9 və cpf1 zülalları qeyri-spesifik DNT-ni çıxarmaq üçün istifadə olunur və sonra bu iki zülal (Cas9 və cpf1) hədəf DNT-yə bağlanmadan əvvəl PAM ardıcıllığını tanıya bilər (Deepak Singh və b., 2021). Beləliklə, PCR xərçəngin inkişafı ilə əlaqəli mutasiyaları müəyyən edə bilər. Bir neçə tədqiqat müxtəlif xərçənglərdə fərqli mutasiyaları aşkar etmək üçün bu CRISPR əsaslı strategiyanı qəbul etmişdir (Safari və b., 2019). Beləliklə, CRISPR əsaslı PCR metodları TNBC diaqnozunun biopsiya əsaslı immunohistokimya kimi invaziv metodlardan asılılığını azalda bilər.
TNBC-də hormon reseptor tənzimlənməsində genotipik dəyişikliklər də nümayiş etdirilmişdir (Chen və Russo, 2009). Tibbi yardım nöqtəsində diaqnostika üçün mikroçiplərdən istifadə edən CRISPR/Cas9 əsaslı PCR strategiyaları bu mutasiyaları effektiv şəkildə izləyə bilər (Hajian və b., 2019). Bu, həmçinin səhiyyə işçilərinə TNBC xəstələrində spesifik mutasiyalar haqqında müvafiq məlumatlar verə bilər ki, bu da onların müalicə kursunu yaxşılaşdırmağa kömək edə bilər. Lakin, bu birləşdirilmiş texnikanın məhdudiyyətləri var. Buna görə də, bu CRISPR/Cas-PCR metodunun TNBC diaqnozu üçün səhiyyədə istifadə edilməsindən əvvəl geniş tədqiqat işləri tələb olunur (Yang və b., 2019).