Kompüter tomoqrafiyası (KT) ilə müəyyən edilmiş ağciyər düyünlərinin diferensial diaqnozu klinik praktikada hələ də çətinlik yaradır. Burada sağlam nəzarət qrupu, xoşxassəli ağciyər düyünləri və I mərhələ ağciyər adenokarsinoması da daxil olmaqla 480 serum nümunəsinin qlobal metabolomunu xarakterizə edirik. Adenokarsinomalar unikal metabolik profillər nümayiş etdirir, xoşxassəli düyünlər və sağlam fərdlər metabolik profillərdə yüksək oxşarlığa malikdirlər. Kəşf qrupunda (n = 306) xoşxassəli və bədxassəli düyünləri fərqləndirmək üçün 27 metabolit dəsti müəyyən edilmişdir. Daxili validasiya (n = 104) və xarici validasiya (n = 111) qruplarında diskriminant modelin AUC müvafiq olaraq 0,915 və 0,945 təşkil etmişdir. Yol təhlili, xoşxassəli düyünlər və sağlam nəzarət qrupu ilə müqayisədə ağciyər adenokarsinoması serumunda triptofanın azalması ilə əlaqəli qlikolitik metabolitlərin artdığını aşkar etdi və triptofanın mənimsənilməsinin ağciyər xərçəngi hüceyrələrində qlikolizi təşviq etdiyini irəli sürdü. Tədqiqatımız, KT ilə aşkar edilən ağciyər düyünlərinin riskini qiymətləndirməkdə serum metabolit biomarkerlərinin dəyərini vurğulayır.
Xərçəng xəstələrinin sağ qalma nisbətlərini artırmaq üçün erkən diaqnoz vacibdir. ABŞ Milli Ağciyər Xərçəngi Skrininq Sınaqının (NLST) və Avropa NELSON Tədqiqatının nəticələri göstərib ki, aşağı dozalı kompüter tomoqrafiyası (LDCT) ilə müayinə yüksək risk qruplarında ağciyər xərçəngindən ölüm hallarını əhəmiyyətli dərəcədə azalda bilər1,2,3. LDCT-nin ağciyər xərçəngi müayinəsi üçün geniş istifadəsindən bəri, asimptomatik ağciyər düyünlərinin təsadüfi rentgenoloji tapıntılarının tezliyi artmaqda davam edir4. Ağciyər düyünləri diametri 3 sm-ə qədər olan fokus bulanıqlığı kimi müəyyən edilir5. Bədxassəli şiş ehtimalını qiymətləndirməkdə və LDCT-də təsadüfən aşkar edilən çox sayda ağciyər düyünləri ilə mübarizə aparmaqda çətinliklərlə qarşılaşırıq. KT-nin məhdudiyyətləri tez-tez təkrar müayinələrə və yalançı müsbət nəticələrə səbəb ola bilər ki, bu da lazımsız müdaxiləyə və həddindən artıq müalicəyə səbəb olur6. Buna görə də, ağciyər xərçəngini erkən mərhələlərdə düzgün müəyyən etmək və ilkin aşkarlamada əksər xoşxassəli düyünləri fərqləndirmək üçün etibarlı və faydalı biomarkerlərin hazırlanmasına ehtiyac var7.
Genomika, proteomika və ya DNT metilləşməsi daxil olmaqla qanın (serum, plazma, periferik qan mononuklear hüceyrələri) hərtərəfli molekulyar analizi ağciyər xərçəngi üçün diaqnostik biomarkerlərin kəşfinə artan marağa səbəb olmuşdur. Bu arada, metabolomika yanaşmaları endogen və ekzogen təsirlərdən təsirlənən hüceyrə son məhsullarını ölçür və buna görə də xəstəliyin başlanğıcını və nəticəsini proqnozlaşdırmaq üçün tətbiq olunur. Maye xromatoqrafiya-tandem kütlə spektrometriyası (LC-MS) yüksək həssaslığı və geniş dinamik diapazonu sayəsində metabolomika tədqiqatları üçün geniş istifadə olunan bir metoddur və müxtəlif fiziki-kimyəvi xüsusiyyətlərə malik metabolitləri əhatə edə bilər11,12,13. Plazma/serumun qlobal metabolomik analizi ağciyər xərçəngi diaqnozu14,15,16,17 və müalicənin effektivliyi ilə əlaqəli biomarkerləri müəyyən etmək üçün istifadə olunsa da,18 xoşxassəli və bədxassəli ağciyər düyünlərini ayırd etmək üçün serum metabolit təsnifatçıları hələ də çox öyrənilməmişdir. - kütləvi tədqiqat.
Adenokarsinoma və skuamöz hüceyrəli karsinoma kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçənginin (KHXK) iki əsas alt növüdür. Müxtəlif KT müayinə testləri göstərir ki, adenokarsinoma ağciyər xərçənginin ən çox yayılmış histoloji növüdür1,19,20,21. Bu tədqiqatda sağlam nəzarət qrupu, xoşxassəli ağciyər düyünləri və KT ilə aşkar edilmiş ≤3 sm daxil olmaqla, cəmi 695 serum nümunəsində metabolomika analizi aparmaq üçün ultra-performanslı maye xromatoqrafiyası-yüksək qətnaməli kütlə spektrometriyasından (UPLC-HRMS) istifadə etdik. I mərhələ ağciyər adenokarsinoması üçün müayinə. Ağciyər adenokarsinomasını xoşxassəli düyünlərdən və sağlam nəzarət qruplarından fərqləndirən bir sıra serum metabolitləri müəyyən etdik. Yol zənginləşdirmə təhlili göstərdi ki, xoşxassəli düyünlər və sağlam nəzarət qrupları ilə müqayisədə ağciyər adenokarsinomasında anormal triptofan və qlükoza metabolizması ümumi dəyişikliklərdir. Nəhayət, erkən differensial diaqnoz və risk qiymətləndirməsinə kömək edə biləcək LDCT ilə aşkar edilən bədxassəli və xoşxassəli ağciyər düyünlərini ayırd etmək üçün yüksək spesifikliyə və həssaslığa malik serum metabolik təsnifatçısını yaratdıq və təsdiqlədik.
Hazırkı tədqiqatda 174 sağlam nəzarət qrupundan, xoşxassəli ağciyər düyünləri olan 292 xəstədən və I mərhələ ağciyər adenokarsinoması olan 229 xəstədən cinsə və yaşa uyğun serum nümunələri retrospektiv olaraq toplanmışdır. 695 subyektin demoqrafik xüsusiyyətləri Əlavə Cədvəl 1-də göstərilmişdir.
Şəkil 1a-da göstərildiyi kimi, Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Mərkəzində 174 sağlam nəzarət (HC), 170 xoşxassəli düyün (BN) və 136 I mərhələ ağciyər adenokarsinoması (LA) nümunələri daxil olmaqla, cəmi 480 serum nümunəsi toplanmışdır. Ultra-performanslı maye xromatoqrafiyası-yüksək qətnaməli kütlə spektrometriyası (UPLC-HRMS) istifadə edərək hədəflənməmiş metabolomik profilləmə üçün kəşf kohortu. Əlavə Şəkil 1-də göstərildiyi kimi, təsnifat modelini yaratmaq və diferensial yol analizini daha da araşdırmaq üçün LA və HC, LA və BN arasındakı diferensial metabolitlər müəyyən edilmişdir. Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Mərkəzi tərəfindən toplanan 104 nümunə və digər iki xəstəxana tərəfindən toplanan 111 nümunə müvafiq olaraq daxili və xarici validasiyaya məruz qalmışdır.
a Kəşf kohortunda ultra-performanslı maye xromatoqrafiyası-yüksək qətnaməli kütlə spektrometriyası (UPLC-HRMS) istifadə edərək qlobal serum metabolomikası analizindən keçmiş tədqiqat populyasiyaları. b Sağlam nəzarət qrupu (HC, n = 174), xoşxassəli düyünlər (BN, n = 170) və I mərhələ ağciyər adenokarsinoması (Los Angeles, n = 136) daxil olmaqla, tədqiqat kohortundan 480 serum nümunəsinin ümumi metabolomunun qismən ən kiçik kvadratlar diskriminant analizi (PLS-DA). +ESI, müsbət elektrosprey ionlaşma rejimi, -ESI, mənfi elektrosprey ionlaşma rejimi. c–e Vulkan qrafikində göstərilən iki verilən qrupda (iki quyruqlu Wilcoxon işarəli ranq testi, yalançı kəşf sürətinin tənzimlənmiş p dəyəri, FDR <0.05) əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bolluqlara malik metabolitlər qırmızı (qat dəyişikliyi > 1.2) və mavi (qat dəyişikliyi <0.83) ilə göstərilir. ). f LA və BN arasında annotasiya olunmuş metabolitlərin sayında əhəmiyyətli fərqləri göstərən iyerarxik klasterləşmə istilik xəritəsi. Mənbə məlumatları mənbə məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Kəşf qrupundakı 174 HC, 170 BN və 136 LA-nın ümumi serum metabolomu UPLC-HRMS analizi istifadə edilərək təhlil edilmişdir. Əvvəlcə keyfiyyətə nəzarət (QC) nümunələrinin nəzarətsiz əsas komponent analizi (PCA) modelinin mərkəzində sıx şəkildə toplandığını və bu da mövcud tədqiqatın göstəricilərinin sabitliyini təsdiqlədiyini göstəririk (Əlavə Şəkil 2).
Şəkil 1b-də qismən ən kiçik kvadratlar ayrı-seçkiliyi analizində (PLS-DA) göstərildiyi kimi, müsbət (+ESI) və mənfi (−ESI) elektrosprey ionlaşma rejimlərində LA və BN, LA və HC arasında aydın fərqlərin olduğunu aşkar etdik. Lakin, +ESI və -ESI şəraitində BN və HC arasında heç bir əhəmiyyətli fərq tapılmadı.
LA və HC arasında 382 diferensial xüsusiyyət, LA və BN arasında 231 diferensial xüsusiyyət və BN və HC arasında 95 diferensial xüsusiyyət tapdıq (Wilcoxon imzalı ranq testi, FDR <0.05 və çoxlu dəyişiklik >1.2 və ya <0.83) (Şəkil .1c-e). . Piklər verilənlər bazasına (mzCloud/HMDB/Chemspider kitabxanası) qarşı m/z dəyəri, saxlama müddəti və parçalanma kütlə spektr axtarışı (ətraflı məlumat Metodlar bölməsində təsvir edilmişdir) ilə əlavə olaraq qeyd edildi (Əlavə Məlumat 3). Nəhayət, müvafiq olaraq LA və BN (Şəkil 1f və Əlavə Cədvəl 2) və LA və HC (Əlavə Şəkil 3 və Əlavə Cədvəl 2) üçün bolluqda əhəmiyyətli fərqlərə malik 33 və 38 qeydli metabolit müəyyən edildi. Bunun əksinə olaraq, BN və HC-də bolluqda əhəmiyyətli fərqlərə malik yalnız 3 metabolit müəyyən edildi (Əlavə Cədvəl 2), bu da PLS-DA-da BN və HC arasındakı üst-üstə düşməyə uyğundur. Bu diferensial metabolitlər geniş biokimyəvi maddələri əhatə edir (Əlavə Şəkil 4). Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr erkən mərhələdə ağciyər xərçənginin bədxassəli transformasiyasını əks etdirən serum metabolomunda əhəmiyyətli dəyişiklikləri göstərir ki, bu da xoşxassəli ağciyər düyünləri və ya sağlam subyektlərlə müqayisədə erkən mərhələdə ağciyər xərçənginin bədxassəli transformasiyasını əks etdirir. Bu arada, BN və HC-nin serum metabolomunun oxşarlığı, xoşxassəli ağciyər düyünlərinin sağlam fərdlərlə bir çox bioloji xüsusiyyətləri paylaşa biləcəyini göstərir. Epidermal böyümə faktoru reseptoru (EGFR) gen mutasiyalarının ağciyər adenokarsinoması alt tipi 23-də yaygın olduğunu nəzərə alaraq, sürücü mutasiyalarının serum metabolomuna təsirini müəyyən etməyə çalışdıq. Daha sonra ağciyər adenokarsinoması qrupunda EGFR statusu olan 72 halın ümumi metabolik profilini təhlil etdik. Maraqlıdır ki, PCA analizində EGFR mutant xəstələri (n = 41) və EGFR vəhşi tip xəstələri (n = 31) arasında müqayisə edilə bilən profillər tapdıq (Əlavə Şəkil 5a). Lakin, EGFR mutasiyası olan xəstələrdə vəhşi tipli EGFR olan xəstələrlə müqayisədə miqdarı əhəmiyyətli dərəcədə dəyişən 7 metabolit müəyyən etdik (t testi, p < 0,05 və qat dəyişikliyi > 1,2 və ya < 0,83) (Əlavə Şəkil 5b). Bu metabolitlərin əksəriyyəti (7-dən 5-i) yağ turşusu oksidləşmə yollarında mühüm rol oynayan asilkarnitinlərdir.
Şəkil 2a-da göstərilən iş axınında göstərildiyi kimi, düyün təsnifatı üçün biomarkerlər ən az mütləq büzülmə operatorları və LA (n = 136) və BN (n = 170)-də müəyyən edilmiş 33 diferensial metabolit əsasında seçim istifadə edilərək əldə edilmişdir. Dəyişənlərin ən yaxşı kombinasiyası (LASSO) – ikili logistik reqressiya modeli. Modelin etibarlılığını yoxlamaq üçün on qat çarpaz validasiya istifadə edilmişdir. Dəyişən seçimi və parametrlərin tənzimlənməsi λ24 parametri ilə ehtimalın maksimumlaşdırılması cəzası ilə tənzimlənir. Qlobal metabolomika təhlili ayrı-seçkilik modelinin təsnifat performansını yoxlamaq üçün daxili validasiya (n = 104) və xarici validasiya (n = 111) qruplarında müstəqil şəkildə aparılmışdır. Nəticədə, kəşf dəstindəki 27 metabolit ən böyük orta AUC dəyərinə malik ən yaxşı diskriminant model kimi müəyyən edilmişdir (Şəkil 2b), bunlardan 9-u BN ilə müqayisədə LA-da artmış, 18-i isə azalmış aktivliyə malik olmuşdur (Şəkil 2c).
Ağciyər düyün təsnifatçısının qurulması üçün iş axını, o cümlədən onqat çarpaz doğrulama vasitəsilə ikili logistik reqressiya modeli istifadə edərək kəşf dəstindəki ən yaxşı serum metabolitləri panelinin seçilməsi və daxili və xarici doğrulama dəstlərində proqnozlaşdırıcı performansın qiymətləndirilməsi. b Metabolik biomarker seçimi üçün LASSO reqressiya modelinin çarpaz doğrulama statistikası. Yuxarıda verilən rəqəmlər müəyyən bir λ-də seçilmiş biomarkerlərin orta sayını təmsil edir. Qırmızı nöqtəli xətt müvafiq lambda-da orta AUC dəyərini təmsil edir. Boz xəta zolaqları minimum və maksimum AUC dəyərlərini təmsil edir. Nöqtəli xətt 27 seçilmiş biomarker ilə ən yaxşı modeli göstərir. AUC, qəbuledicinin işləmə xarakteristikası (ROC) əyrisi altındakı sahə. c Kəşf qrupundakı BN qrupu ilə müqayisədə LA qrupundakı 27 seçilmiş metabolitdə qat dəyişiklikləri. Qırmızı sütun - aktivləşmə. Mavi sütun azalmadır. d–f Kəşf, daxili və xarici doğrulama dəstlərindəki 27 metabolit kombinasiyasına əsaslanan diskriminant modelin gücünü göstərən qəbuledicinin işləmə xarakteristikası (ROC) əyriləri. Mənbə məlumatları mənbə məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Bu 27 metabolitinin çəkili reqressiya əmsallarına əsaslanaraq proqnozlaşdırma modeli yaradılmışdır (Əlavə Cədvəl 3). Bu 27 metabolit əsasında aparılan ROC analizi əyri altındakı sahənin (AUC) dəyəri 0,933, kəşf qrupunun həssaslığı 0,868 və spesifiklik 0,859 olduğunu göstərdi (Şəkil 2d). Bu arada, LA və HC arasındakı 38 şərhli diferensial metabolit arasında 16 metabolitdən ibarət dəst, LA-nı HC-dən ayırmaqda 0,801 həssaslıq və 0,856 spesifiklik ilə 0,902 AUC əldə etdi (Əlavə Şəkil 6a-c). Diferensial metabolitlər üçün müxtəlif qat dəyişikliyi hədlərinə əsaslanan AUC dəyərləri də müqayisə edildi. Təsnifat modelinin qat dəyişikliyi səviyyəsi 1,5 və ya 2,0-yə qarşı 1,2-yə təyin edildikdə LA və BN (HC) arasında ayırmaqda ən yaxşı nəticə göstərdiyini aşkar etdik (Əlavə Şəkil 7a,b). 27 metabolit qrupuna əsaslanan təsnifat modeli daxili və xarici kohortlarda daha da təsdiqləndi. AUC daxili təsdiqləmə üçün 0.915 (həssaslıq 0.867, spesifiklik 0.811) və xarici təsdiqləmə üçün 0.945 (həssaslıq 0.810, spesifiklik 0.979) idi (Şəkil 2e, f). Laboratoriyalararası səmərəliliyi qiymətləndirmək üçün xarici kohortdan 40 nümunə Metodlar bölməsində təsvir edildiyi kimi xarici laboratoriyada təhlil edildi. Təsnifat dəqiqliyi 0.925 AUC-yə çatdı (Əlavə Şəkil 8). Ağciyər yastı hüceyrəli karsinoması (LUSC) ağciyər adenokarsinomasından (LUAD) sonra qeyri-kiçik hüceyrəli ağciyər xərçənginin (NSCLC) ikinci ən çox yayılmış alt növü olduğundan, metabolik profillərin təsdiqlənmiş potensial faydasını da sınaqdan keçirdik. BN və 16 LUSC hadisəsi. LUSC və BN arasındakı fərqləndirmənin AUC-si 0.776 idi (Əlavə Şəkil 9), bu da LUAD və BN arasındakı fərqləndirmə ilə müqayisədə daha zəif qabiliyyət olduğunu göstərir.
Tədqiqatlar göstərmişdir ki, KT görüntülərindəki düyünlərin ölçüsü bədxassəli şiş ehtimalı ilə müsbət korrelyasiyaya malikdir və düyün müalicəsinin əsas müəyyənedicisi olaraq qalır25,26,27. NELSON skrininq tədqiqatının böyük kohortasından əldə edilən məlumatların təhlili göstərdi ki, düyünləri <5 mm olan subyektlərdə bədxassəli şiş riski hətta düyünləri olmayan subyektlərdəki riskə bənzəyir28. Buna görə də, müntəzəm KT monitorinqini tələb edən minimum ölçü Britaniya Torakal Cəmiyyəti (BTS) tərəfindən tövsiyə edildiyi kimi 5 mm, Fleischner Cəmiyyəti tərəfindən tövsiyə edildiyi kimi isə 6 mm-dir29. Lakin, 6 mm-dən böyük və aşkar xoşxassəli xüsusiyyətləri olmayan, qeyri-müəyyən ağciyər düyünləri (IPN) adlanan düyünlər klinik praktikada qiymətləndirmə və idarəetmədə əsas problem olaraq qalır30,31. Daha sonra kəşf və daxili validasiya kohortlarından götürülmüş nümunələrdən istifadə edərək düyün ölçüsünün metabolik imzalara təsir edib-etmədiyini araşdırdıq. 27 validasiya olunmuş biomarkerə diqqət yetirərək, əvvəlcə HC və BN alt-6 mm metabolomlarının PCA profillərini müqayisə etdik. HC və BN üçün məlumat nöqtələrinin əksəriyyətinin üst-üstə düşdüyünü aşkar etdik ki, bu da hər iki qrupda serum metabolit səviyyələrinin oxşar olduğunu göstərir (Şəkil 3a). Müxtəlif ölçülü diapazonlardakı xüsusiyyət xəritələri BN və LA-da qorunub saxlanılmışdır (Şəkil 3b, c), 6-20 mm diapazonunda isə bədxassəli və xoşxassəli düyünlər arasında fərq müşahidə edilmişdir (Şəkil 3d). Bu kohortun AUC-si 0,927, spesifikliyi 0,868 və 6-20 mm ölçülü düyünlərin bədxassəliliyini proqnozlaşdırmaq üçün 0,820 həssaslığı var idi (Şəkil 3e, f). Nəticələrimiz göstərir ki, təsnifatçı düyün ölçüsündən asılı olmayaraq erkən bədxassəli transformasiyanın yaratdığı metabolik dəyişiklikləri ələ keçirə bilər.
ad 27 metabolitdən ibarət metabolik təsnifatçıya əsasən müəyyən qruplar arasında PCA profillərinin müqayisəsi. CC və BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. LA 6–20 mm-də LA 20–30 mm-ə qarşı. g BN 6–20 mm və LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e 6–20 mm düyünlər üçün diskriminant model performansını göstərən qəbuledicinin işləmə xarakteristikası (ROC) əyrisi. f Ehtimal dəyərləri 6–20 mm ölçülü düyünlər üçün logistik reqressiya modelinə əsasən hesablanmışdır. Boz nöqtəli xətt optimal kəsmə dəyərini (0.455) təmsil edir. Yuxarıdakı rəqəmlər Los-Anceles üçün proqnozlaşdırılan halların faizini təmsil edir. İki quyruqlu Student t testindən istifadə edin. PCA, əsas komponent təhlili. Əyri altındakı AUC sahəsi. Mənbə məlumatları mənbə məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Təklif olunan bədxassəli şiş proqnozlaşdırma modelinin performansını göstərmək üçün oxşar ağciyər düyünlərinin ölçülərinə (7-9 mm) malik dörd nümunə (44-61 yaş) əlavə olaraq seçildi (Şəkil 4a, b). İlkin müayinədə 1-ci hal xoşxassəli şişlə əlaqəli bir xüsusiyyət olan kalsifikasiyalı bərk düyün kimi təqdim edildi, 2-ci hal isə aşkar xoşxassəli xüsusiyyətləri olmayan qeyri-müəyyən qismən bərk düyün kimi təqdim edildi. Üç mərhələli izləmə KT müayinələri göstərdi ki, bu hallar 4 illik müddət ərzində sabit qalıb və buna görə də xoşxassəli düyünlər hesab olunur (Şəkil 4a). Seriyalı KT müayinələrinin klinik qiymətləndirilməsi ilə müqayisədə, mövcud təsnifat modeli ilə tək vuruşlu serum metabolit analizi bu xoşxassəli düyünləri ehtimal məhdudiyyətlərinə əsasən tez və düzgün müəyyən etdi (Cədvəl 1). 3-cü haldakı Şəkil 4b, ən çox bədxassəli şişlə əlaqəli olan plevral geri çəkilmə əlamətləri olan bir düyün göstərir32. 4-cü hal, xoşxassəli səbəbə dair heç bir dəlil olmayan qeyri-müəyyən qismən bərk düyün kimi təqdim edildi. Bütün bu hallar təsnifatçı modelinə əsasən bədxassəli kimi proqnozlaşdırılıb (Cədvəl 1). Ağciyər adenokarsinomasının qiymətləndirilməsi ağciyər rezeksiyası əməliyyatından sonra histopatoloji müayinə ilə nümayiş etdirilib (Şəkil 4b). Xarici validasiya dəsti üçün metabolik təsnifatçı 6 mm-dən böyük olan qeyri-müəyyən ağciyər düyünlərinin iki halını dəqiq proqnozlaşdırıb (Əlavə Şəkil 10).
İki xoşxassəli düyün halının ağciyərlərinin aksial pəncərəsinin KT görüntüləri. 1-ci halda, 4 ildən sonra KT müayinəsi sağ alt payda kalsifikasiya ilə 7 mm ölçülü sabit bərk düyün göstərdi. 2-ci halda, 5 ildən sonra KT müayinəsi sağ yuxarı payda diametri 7 mm olan sabit, qismən bərk düyün aşkar etdi. b Ağciyərlərin aksial pəncərə KT görüntüləri və ağciyər rezeksiyasından əvvəl I mərhələ adenokarsinomasının iki halının müvafiq patoloji tədqiqatları. 3-cü halda sağ yuxarı payda plevral retraksiya ilə diametri 8 mm olan bir düyün aşkar edildi. 4-cü halda sol yuxarı payda 9 mm ölçülü qismən bərk üyüdülmüş şüşə düyün aşkar edildi. Rezeksiya edilmiş ağciyər toxumasının hematoksilin və eozin (H&E) boyanması (miqyas zolağı = 50 μm) ağciyər adenokarsinomasının asinar böyümə modelini göstərir. Oxlar KT görüntülərində aşkar edilmiş düyünləri göstərir. H&E görüntüləri patoloq tərəfindən müayinə edilən çoxsaylı (>3) mikroskopik sahələrin təmsilçi görüntüləridir.
Ümumilikdə, nəticələrimiz ağciyər düyünlərinin diferensial diaqnozunda serum metabolit biomarkerlərinin potensial dəyərini nümayiş etdirir ki, bu da KT müayinəsinin qiymətləndirilməsində çətinliklər yarada bilər.
Təsdiqlənmiş diferensial metabolit panelinə əsaslanaraq, əsas metabolik dəyişikliklərin bioloji korrelyasiyalarını müəyyən etməyə çalışdıq. MetaboAnalyst tərəfindən aparılan KEGG yol zənginləşdirmə təhlili, verilən iki qrup arasında 6 ümumi əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş yol müəyyən etdi (LA vs. HC və LA vs. BN, tənzimlənmiş p ≤ 0.001, təsir > 0.01). Bu dəyişikliklər piruvat metabolizmasında, triptofan metabolizmasında, niasin və nikotinamid metabolizmasında, qlikolizdə, TCA dövründə və purin metabolizmasında pozğunluqlar ilə xarakterizə olunurdu (Şəkil 5a). Daha sonra mütləq kəmiyyətləndirmədən istifadə edərək əsas dəyişiklikləri yoxlamaq üçün hədəf metabolomikası apardıq. Orijinal metabolit standartlarından istifadə edərək ümumi dəyişdirilmiş yollardakı ümumi metabolitlərin üçqat kvadrupol kütlə spektrometriyası (QQQ) ilə təyini. Metabolomika tədqiqatının hədəf nümunəsinin demoqrafik xüsusiyyətləri Əlavə Cədvəl 4-də verilmişdir. Qlobal metabolomika nəticələrimizə uyğun olaraq, kəmiyyət təhlili hipoksantin və ksantin, piruvat və laktatın LA-da BN və HC ilə müqayisədə artdığını təsdiqlədi (Şəkil 5b, c, p <0.05). Lakin, bu metabolitlərdə BN və HC arasında heç bir əhəmiyyətli fərq aşkar edilmədi.
LA qrupunda BN və HC qrupları ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə fərqli metabolitlərin KEGG yol zənginləşdirmə təhlili. İki quyruqlu Qlobaltest istifadə edildi və p dəyərləri Holm-Bonferroni metodu ilə tənzimləndi (tənzimlənmiş p ≤ 0.001 və təsir ölçüsü > 0.01). b–d Serum HC, BN və LA-da hipoksantin, ksantin, laktat, piruvat və triptofan səviyyələrini göstərən skripka qrafikləri LC-MS/MS ilə müəyyən edilir (qrup başına n = 70). Ağ və qara nöqtəli xətlər müvafiq olaraq median və kvartili göstərir. e LUAD-TCGA məlumat dəstində normal ağciyər toxuması (n = 59) ilə müqayisədə ağciyər adenokarsinomasında SLC7A5 və QPRT-nin normallaşdırılmış Log2TPM (milyon başına transkriptlər) mRNA ifadəsini (n = 513) göstərən skripka qrafiki. Ağ qutu kvartillərarası diapazonu, mərkəzdəki üfüqi qara xətt medianı, qutudan uzanan şaquli qara xətt isə 95% etibarlılıq intervalını (Eİ) təmsil edir. f TCGA məlumat dəstində ağciyər adenokarsinomasında (n = 513) və normal ağciyər toxumasında (n = 59) SLC7A5 və GAPDH ifadəsinin Pearson korrelyasiya qrafiki. Boz sahə 95% Eİ-ni təmsil edir. r, Pearson korrelyasiya əmsalı. g LC-MS/MS ilə müəyyən edilmiş qeyri-spesifik shRNA nəzarəti (NC) və shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ilə transfeksiya edilmiş A549 hüceyrələrində normallaşdırılmış hüceyrə triptofan səviyyələri. Hər qrupda beş bioloji cəhətdən müstəqil nümunənin statistik təhlili təqdim olunur. h A549 hüceyrələrində (NC) və SLC7A5 nokdaun A549 hüceyrələrində (Sh1, Sh2) NADt-nin hüceyrə səviyyələri (ümumi NAD, NAD+ və NADH daxil olmaqla). Hər qrupda üç bioloji cəhətdən müstəqil nümunənin statistik təhlili təqdim olunur. i SLC7A5-in yıxılmasından əvvəl və sonra A549 hüceyrələrinin qlikolitik aktivliyi hüceyrədənkənar turşuluq dərəcəsi (ECAR) ilə ölçüldü (qrup başına n = 4 bioloji cəhətdən müstəqil nümunə). 2-DG, 2-deoksi-D-qlükoza. (b–h)-də iki quyruqlu Student t testi istifadə edilmişdir. (g–i)-də səhv zolaqları orta ± SD-ni təmsil edir, hər təcrübə üç dəfə müstəqil şəkildə aparılmışdır və nəticələr oxşar olmuşdur. Mənbə məlumatları mənbə məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
LA qrupunda triptofan metabolizmasının dəyişməsinin əhəmiyyətli təsirini nəzərə alaraq, QQQ istifadə edərək HC, BN və LA qruplarında serum triptofan səviyyələrini də qiymətləndirdik. Müəyyən etdik ki, serum triptofan LA-da HC və ya BN ilə müqayisədə azalıb (p < 0.001, Şəkil 5d), bu da ağciyər xərçəngi xəstələrində dövran edən triptofan səviyyələrinin nəzarət qrupundakı sağlam nəzarət qrupuna nisbətən daha aşağı olduğuna dair əvvəlki tapıntılarla uyğun gəlir33,34,35. PET/KT izləyicisi 11C-metil-L-triptofan istifadə edən başqa bir tədqiqatda ağciyər xərçəngi toxumasında triptofan siqnalının saxlanma müddətinin xoşxassəli lezyonlar və ya normal toxuma ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artdığı aşkar edilmişdir36. Biz fərz edirik ki, LA serumunda triptofanın azalması ağciyər xərçəngi hüceyrələri tərəfindən aktiv triptofan udulmasını əks etdirə bilər.
Triptofan katabolizminin kinurenin yolunun son məhsulunun qlikolizdə qliseraldehid-3-fosfatın 1,3-bisfosfoqliseratla reaksiyası üçün vacib substrat olan NAD+37,38 olduğu da məlumdur39. Əvvəlki tədqiqatlar triptofan katabolizminin immun tənzimlənməsindəki roluna yönəlsə də, biz cari tədqiqatda müşahidə olunan triptofan disrequlyasiyası ilə qlikolitik yollar arasındakı qarşılıqlı təsiri aydınlaşdırmağa çalışdıq. Həll olan daşıyıcı ailəsi 7 üzv 5-in (SLC7A5) triptofan daşıyıcısı olduğu bilinir43,44,45. Xinolin turşusu fosforiboziltransferaza (QPRT), kinolin turşusunu NAMN46-ya çevirən kinurenin yolunun aşağı hissəsində yerləşən bir fermentdir. LUAD TCGA məlumat dəstinin yoxlanılması həm SLC7A5, həm də QPRT-nin normal toxuma ilə müqayisədə şiş toxumasında əhəmiyyətli dərəcədə yüksəldiyini aşkar etdi (Şəkil 5e). Bu artım ağciyər adenokarsinomasının I və II mərhələlərində, eləcə də III və IV mərhələlərində müşahidə edilmişdir (Əlavə Şəkil 11), bu da şiş əmələ gəlməsi ilə əlaqəli triptofan metabolizmasında erkən pozğunluqları göstərir.
Bundan əlavə, LUAD-TCGA məlumat dəsti xərçəng xəstəsi nümunələrində SLC7A5 və GAPDH mRNA ifadəsi arasında müsbət korrelyasiya göstərdi (r = 0.45, p = 1.55E-26, Şəkil 5f). Bunun əksinə olaraq, normal ağciyər toxumasında bu cür gen imzaları arasında heç bir əhəmiyyətli korrelyasiya tapılmadı (r = 0.25, p = 0.06, Şəkil 5f). A549 hüceyrələrində SLC7A5-in (Əlavə Şəkil 12) nakaut edilməsi hüceyrə triptofan və NAD(H) səviyyələrini əhəmiyyətli dərəcədə azaltdı (Şəkil 5g,h), hüceyrədənkənar turşuluq dərəcəsi (ECAR) ilə ölçüldüyü kimi qlikolitik aktivliyin azalmasına səbəb oldu (Şəkil 1). 5i). Beləliklə, serumda və in vitro aşkarlamada metabolik dəyişikliklərə əsaslanaraq, triptofan metabolizmasının kinurenin yolu ilə NAD+ istehsal edə biləcəyini və ağciyər xərçəngində qlikolizi təşviq etməkdə mühüm rol oynaya biləcəyini fərz edirik.
Tədqiqatlar göstərir ki, LDCT ilə aşkar edilən çox sayda qeyri-müəyyən ağciyər düyünləri, bədxassəli şişin yalançı müsbət diaqnozu səbəbindən PET-KT, ağciyər biopsiyası və həddindən artıq müalicə kimi əlavə testlərə ehtiyac yarada bilər.31 Şəkil 6-da göstərildiyi kimi, tədqiqatımız KT ilə aşkar edilən ağciyər düyünlərinin risk təbəqələşməsini və sonrakı idarə olunmasını yaxşılaşdıra biləcək potensial diaqnostik dəyəri olan bir sıra serum metabolitlərini müəyyən etdi.
Ağciyər düyünləri, xoşxassəli və ya bədxassəli səbəbləri göstərən görüntüləmə xüsusiyyətləri ilə aşağı dozalı kompüter tomoqrafiyası (LDCT) istifadə edilərək qiymətləndirilir. Düyünlərin qeyri-müəyyən nəticəsi tez-tez müşahidə müayinələrinə, lazımsız müdaxilələrə və həddindən artıq müalicəyə səbəb ola bilər. Diaqnostik dəyəri olan serum metabolik təsnifatçılarının daxil edilməsi risk qiymətləndirməsini və ağciyər düyünlərinin sonrakı idarə olunmasını yaxşılaşdıra bilər. PET pozitron emissiya tomoqrafiyası.
ABŞ NLST tədqiqatının və Avropa NELSON tədqiqatının məlumatları göstərir ki, yüksək risk qruplarının aşağı dozalı kompüter tomoqrafiyası (LDCT) ilə müayinəsi ağciyər xərçəngindən ölüm hallarını azalda bilər1,3. Bununla belə, LDCT tərəfindən aşkar edilən çox sayda təsadüfi ağciyər düyünlərinin risk qiymətləndirilməsi və sonrakı klinik idarə olunması ən çətin məsələ olaraq qalır. Əsas məqsəd etibarlı biomarkerləri daxil etməklə mövcud LDCT əsaslı protokolların düzgün təsnifatını optimallaşdırmaqdır.
Qan metabolitləri kimi müəyyən molekulyar biomarkerlər ağciyər xərçəngini sağlam nəzarət qrupu ilə müqayisə etməklə müəyyən edilmişdir15,17. Hazırkı tədqiqatda, LDCT tərəfindən təsadüfən aşkar edilən xoşxassəli və bədxassəli ağciyər düyünlərini ayırd etmək üçün serum metabolomikası analizinin tətbiqinə diqqət yetirdik. UPLC-HRMS analizindən istifadə edərək sağlam nəzarət (HC), xoşxassəli ağciyər düyünlərinin (BN) və I mərhələ ağciyər adenokarsinoması (LA) nümunələrinin qlobal serum metabolomunu müqayisə etdik. HC və BN-nin oxşar metabolik profillərə malik olduğunu, LA-nın isə HC və BN ilə müqayisədə əhəmiyyətli dəyişikliklər göstərdiyini aşkar etdik. LA-nı HC və BN-dən fərqləndirən iki serum metabolit dəsti müəyyən etdik.
Xoşxassəli və bədxassəli düyünlər üçün mövcud LDCT əsaslı identifikasiya sxemi əsasən düyünlərin zamanla ölçüsünə, sıxlığına, morfologiyasına və böyümə sürətinə əsaslanır30. Əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, düyünlərin ölçüsü ağciyər xərçəngi ehtimalı ilə sıx bağlıdır. Hətta yüksək riskli xəstələrdə belə, 6 mm-dən az düyünlərdə bədxassəli şiş riski <1% -dir. 6 ilə 20 mm arasında olan düyünlər üçün bədxassəli şiş riski 8%-dən 64%-ə qədər dəyişir30. Buna görə də, Fleischner Cəmiyyəti rutin KT izləməsi üçün 6 mm kəsmə diametri tövsiyə edir.29 Lakin, 6 mm-dən böyük qeyri-müəyyən ağciyər düyünlərinin (İQN) risk qiymətləndirilməsi və idarə olunması kifayət qədər aparılmayıb31. Anadangəlmə ürək xəstəliyinin hazırkı idarə olunması adətən tez-tez KT monitorinqi ilə diqqətli gözləməyə əsaslanır.
Təsdiqlənmiş metabolom əsasında, ilk dəfə sağlam fərdlər və <6 mm xoşxassəli düyünlər arasında metabolik imzaların üst-üstə düşdüyünü nümayiş etdirdik. Bioloji oxşarlıq, <6 mm düyünlər üçün bədxassəli şiş riskinin düyünləri olmayan subyektlər qədər aşağı olduğunu göstərən əvvəlki KT tapıntıları ilə uyğun gəlir.30 Qeyd etmək lazımdır ki, nəticələrimiz həmçinin <6 mm və ≥6 mm ölçülü xoşxassəli düyünlərin metabolik profillərdə yüksək oxşarlığa malik olduğunu göstərir ki, bu da xoşxassəli etiologiyanın funksional tərifinin düyün ölçüsündən asılı olmayaraq ardıcıl olduğunu göstərir. Beləliklə, müasir diaqnostik serum metabolit panelləri KT-də düyünlər ilkin olaraq aşkar edildikdə istisna testi kimi tək bir analiz təmin edə bilər və seriyalı monitorinqi potensial olaraq azalda bilər. Eyni zamanda, eyni metabolik biomarkerlər paneli ≥6 mm ölçülü bədxassəli düyünləri xoşxassəli düyünlərdən fərqləndirdi və oxşar ölçülü IPN-lər və KT görüntülərində qeyri-müəyyən morfoloji xüsusiyyətlər üçün dəqiq proqnozlar verdi. Bu serum metabolizması təsnifatçısı ≥6 mm ölçülü düyünlərin bədxassəli şişini 0,927 AUC ilə proqnozlaşdırmaqda yaxşı nəticə göstərdi. Ümumilikdə, nəticələrimiz göstərir ki, unikal serum metabolik imzaları şişin erkən induksiya etdiyi metabolik dəyişiklikləri əks etdirə bilər və düyün ölçüsündən asılı olmayaraq risk proqnozlaşdırıcıları kimi potensial dəyərə malikdir.
Xüsusilə, ağciyər adenokarsinoması (LUAD) və yastı hüceyrəli karsinoma (LUSC) kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçənginin (NSCLC) əsas növləridir. LUSC-nin tütün istifadəsi ilə güclü şəkildə əlaqəli olduğunu47 və LUAD-ın KT müayinəsində aşkar edilən təsadüfi ağciyər düyünlərinin ən çox yayılmış histologiyası olduğunu48 nəzərə alsaq, təsnifat modelimiz xüsusilə I mərhələ adenokarsinoma nümunələri üçün qurulmuşdur. Vanq və həmkarları həmçinin LUAD-a diqqət yetirdilər və erkən mərhələli ağciyər xərçəngini sağlam fərdlərdən ayırmaq üçün lipidomiklərdən istifadə edərək doqquz lipid imzasını müəyyən etdilər17. Mövcud təsnifat modelini I mərhələli LUSC-nin 16 halında və 74 xoşxassəli düyündə sınaqdan keçirdik və aşağı LUSC proqnozlaşdırma dəqiqliyini (AUC 0.776) müşahidə etdik ki, bu da LUAD və LUSC-nin öz metabolik imzalarına malik ola biləcəyini göstərir. Həqiqətən də, LUAD və LUSC-nin etiologiyası, bioloji mənşəyi və genetik anomaliyaları baxımından fərqləndiyi göstərilmişdir49. Buna görə də, skrininq proqramlarında ağciyər xərçənginin populyasiyaya əsaslanan aşkarlanması üçün təlim modellərinə digər histologiya növləri daxil edilməlidir.
Burada sağlam nəzarət və xoşxassəli düyünlərlə müqayisədə ağciyər adenokarsinomasında ən çox dəyişdirilən altı yolu müəyyən etdik. Ksantin və hipoksantin purin metabolik yolunun ümumi metabolitləridir. Nəticələrimizə uyğun olaraq, sağlam nəzarət və ya preinvaziv mərhələdəki xəstələrlə müqayisədə ağciyər adenokarsinoması olan xəstələrin serumunda və ya toxumalarında purin metabolizmi ilə əlaqəli aralıq maddələr əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır15,50. Serumda ksantin və hipoksantin səviyyələrinin artması sürətlə çoxalan xərçəng hüceyrələri tərəfindən tələb olunan anabolizmi əks etdirə bilər. Qlükoza metabolizmasının pozulması xərçəng metabolizmasının tanınmış bir əlamətidir51. Burada HC və BN qrupu ilə müqayisədə LA qrupunda piruvat və laktatın əhəmiyyətli dərəcədə artdığını müşahidə etdik ki, bu da kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçəngi (NSCLC) xəstələrinin və sağlam nəzarət qrupunun serum metabolom profillərində qlikolitik yol anomaliyaları ilə bağlı əvvəlki məlumatlarla uyğundur. Nəticələr ardıcıldır52,53.
Əhəmiyyətli olan odur ki, ağciyər adenokarsinomalarının serumunda piruvat və triptofan metabolizması arasında tərs korrelyasiya müşahidə etdik. LA qrupunda serum triptofan səviyyələri HC və ya BN qrupu ilə müqayisədə azalmışdır. Maraqlıdır ki, prospektiv kohortdan istifadə edərək aparılan əvvəlki genişmiqyaslı bir tədqiqat, dövran edən triptofanın aşağı səviyyələrinin ağciyər xərçəngi riskinin artması ilə əlaqəli olduğunu aşkar etmişdir 54. Triptofan tamamilə qidadan aldığımız vacib bir amin turşusudur. Ağciyər adenokarsinomasında serum triptofan tükənməsinin bu metabolitin sürətli tükənməsini əks etdirə biləcəyi qənaətinə gəlirik. Kinurenin yolu ilə triptofan katabolizminin son məhsulunun de novo NAD+ sintezinin mənbəyi olduğu məlumdur. NAD+ əsasən xilasetmə yolu ilə istehsal olunduğundan, sağlamlıq və xəstəlikdə triptofan metabolizmasında NAD+-ın əhəmiyyəti hələ də müəyyən edilməmişdir46. TCGA verilənlər bazasının təhlili göstərdi ki, triptofan daşıyıcısı həll olan maddə daşıyıcısı 7A5-in (SLC7A5) ifadəsi ağciyər adenokarsinomasında normal nəzarət qrupu ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmış və qlikolitik ferment GAPDH-nin ifadəsi ilə müsbət korrelyasiya olunmuşdur. Əvvəlki tədqiqatlar əsasən triptofan katabolizminin şiş əleyhinə immun reaksiyasının yatırılmasındakı roluna yönəlmişdir40,41,42. Burada biz göstəririk ki, ağciyər xərçəngi hüceyrələrində SLC7A5-in tıxanması ilə triptofan qəbulunun inhibə edilməsi hüceyrə NAD səviyyələrinin sonrakı azalmasına və qlikolitik aktivliyin eyni vaxtda zəifləməsinə səbəb olur. Xülasə, tədqiqatımız ağciyər adenokarsinomasının bədxassəli transformasiyası ilə əlaqəli serum metabolizmasında dəyişikliklər üçün bioloji əsas təqdim edir.
EGFR mutasiyaları NSCLC xəstələrində ən çox yayılmış hərəkətverici mutasiyalardır. Tədqiqatımızda EGFR mutasiyası olan xəstələrin (n = 41) ümumi metabolik profillərinin vəhşi tipli EGFR (n = 31) xəstələrinə bənzər olduğunu aşkar etdik, baxmayaraq ki, asilkarnitin xəstələrində bəzi EGFR mutant xəstələrində serum səviyyələrinin azaldığını aşkar etdik. Asilkarnitinlərin müəyyən edilmiş funksiyası asil qruplarını sitoplazmadan mitoxondrial matrisə daşımaq və bu da yağ turşularının oksidləşməsinə səbəb olaraq enerji istehsal etməkdir 55. Tapıntılarımıza uyğun olaraq, son bir araşdırma da 102 ağciyər adenokarsinoma toxuma nümunəsinin qlobal metabolomunu təhlil edərək EGFR mutant və EGFR vəhşi tipli şişlər arasında oxşar metabolom profillərini müəyyən etdi50. Maraqlıdır ki, asilkarnitin tərkibi EGFR mutant qrupunda da tapılmışdır. Buna görə də, asilkarnitin səviyyələrindəki dəyişikliklərin EGFR tərəfindən induksiya edilmiş metabolik dəyişiklikləri və əsas molekulyar yolları əks etdirib-etdirməməsi daha ətraflı tədqiqata layiq ola bilər.
Nəticə olaraq, tədqiqatımız ağciyər düyünlərinin diferensial diaqnozu üçün serum metabolik təsnifatçısını yaradır və KT müayinəsinə əsaslanaraq risk qiymətləndirməsini optimallaşdıra və klinik idarəetməni asanlaşdıra bilən bir iş axını təklif edir.
Bu tədqiqat Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Xəstəxanasının Etika Komitəsi, Sun Yat-sen Universitetinin Birinci Bağlı Xəstəxanası və Zhengzhou Universiteti Xərçəng Xəstəxanasının Etika Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmişdir. Kəşf və daxili validasiya qruplarında, Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Mərkəzinin Xərçəngə Nəzarət və Profilaktika şöbəsində illik tibbi müayinədən keçən şəxslərdən sağlam fərdlərdən 174 serum və xoşxassəli düyünlərdən 244 serum və 166 xoşxassəli düyün toplanmışdır. I Mərhələ ağciyər adenokarsinomaları Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Mərkəzindən toplanmışdır. Xarici validasiya kohortasında, Sun Yat-sen Universitetinin Birinci Bağlı Xəstəxanasından 48 xoşxassəli düyün, 39 I mərhələ ağciyər adenokarsinoması və 24 I mərhələ ağciyər adenokarsinoması hadisəsi olmuşdur. Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Mərkəzi həmçinin müəyyən edilmiş metabolik təsnifatçının diaqnostik qabiliyyətini yoxlamaq üçün I mərhələli skuamöz hüceyrəli ağciyər xərçənginin 16 halını topladı (xəstənin xüsusiyyətləri Əlavə Cədvəl 5-də göstərilib). Kəşf kohortundan və daxili validasiya kohortundan nümunələr 2018-ci ilin yanvar ayı ilə 2020-ci ilin may ayı arasında toplanmışdır. Xarici validasiya kohortu üçün nümunələr 2021-ci ilin avqust ayı ilə 2022-ci ilin oktyabr ayı arasında toplanmışdır. Cins qərəzliliyini minimuma endirmək üçün hər kohorta təxminən bərabər sayda kişi və qadın halları təyin edilmişdir. Kəşf Qrupu və Daxili İcmal Qrupu. İştirakçının cinsi özünün hesabatına əsasən müəyyən edilmişdir. Bütün iştirakçılardan məlumatlı razılıq alınmış və heç bir kompensasiya təmin edilməmişdir. Xoşxassəli düyünləri olan subyektlər, əməliyyatdan əvvəl toplanan və histopatologiya ilə diaqnoz qoyulmuş xarici validasiya nümunəsindən 1 hal istisna olmaqla, analiz zamanı 2 ildən 5 ilə qədər sabit KT müayinəsi balı olanlar idi. Xroniki bronxit istisna olmaqla. Ağciyər adenokarsinoması halları ağciyər rezeksiyasından əvvəl toplanmış və patoloji diaqnozla təsdiqlənmişdir. Acqarına qan nümunələri heç bir antikoaqulyant olmadan serum ayırma borularında toplanmışdır. Qan nümunələri otaq temperaturunda 1 saat laxtalandı və sonra serum supernatantını toplamaq üçün 2851 × g-də 10 dəqiqə 4°C-də santrifüj edildi. Serum alikvotları metabolit çıxarılana qədər -80°C-də donduruldu. Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Mərkəzinin Xərçəngin Qarşısının Alınması və Tibbi Müayinə şöbəsi, 40-55 yaş arası bərabər sayda kişi və qadın da daxil olmaqla, 100 sağlam donordan serum hovuzu topladı. Hər donor nümunəsinin bərabər həcmləri qarışdırıldı, nəticədə yaranan hovuz alikvotasiya edildi və -80°C-də saxlanıldı. Serum qarışığı keyfiyyətə nəzarət və məlumatların standartlaşdırılması üçün istinad materialı kimi istifadə edildi.
Referans serumu və test nümunələri əridildi və metabolitlər birləşdirilmiş ekstraksiya metodu (MTBE/metanol/su) ilə çıxarıldı 56. Qısaca desək, 50 μl serum 225 μl buz kimi soyuq metanol və 750 μl buz kimi soyuq metil tert-butil efiri (MTBE) ilə qarışdırıldı. Qarışığı qarışdırın və 1 saat buz üzərində inkubasiya edin. Daha sonra nümunələr qarışdırıldı və Cambridge İzotop Laboratoriyalarından alınmış daxili standartlar (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin və 13C6-izoleysin) olan 188 μl MS dərəcəli su ilə qarışdırıldı. Daha sonra qarışıq 4 °C-də 10 dəqiqə ərzində 15000 × g-də santrifüj edildi və aşağı faza müsbət və mənfi rejimlərdə LC-MS analizi üçün iki boruya (hər biri 125 μL) köçürüldü. Nəhayət, nümunə yüksək sürətli vakuum konsentratorunda quruyana qədər buxarlandı.
Qurudulmuş metabolitlər 120 μl 80% asetonitrildə bərpa edildi, 5 dəqiqə vorteks edildi və 4°C-də 10 dəqiqə 15000 × g-də santrifüj edildi. Supernatantlar metabolomika tədqiqatları üçün mikro əlavələri olan kəhrəba şüşə flakonlara köçürüldü. Ultra-performanslı maye xromatoqrafiyası-yüksək qətnaməli kütlə spektrometriyası (UPLC-HRMS) platformasında hədəflənməmiş metabolomika təhlili. Metabolitlər Dionex Ultimate 3000 UPLC sistemi və ACQUITY BEH Amid sütunu (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) istifadə edilərək ayrıldı. Müsbət ion rejimində mobil fazalar 95% (A) və 50% asetonitril (B) idi, hər biri 10 mmol/L ammonium asetat və 0.1% qarışqa turşusu ehtiva edirdi. Mənfi rejimdə, A və B mobil fazaları müvafiq olaraq 95% və 50% asetonitril ehtiva edirdi, hər iki fazada 10 mmol/L ammonium asetat var idi, pH = 9. Qradiyent proqramı aşağıdakı kimi idi: 0–0.5 dəq, 2% B; 0.5–12 dəq, 2–50% B; 12–14 dəq, 50–98% B; 14–16 dəq, 98% B; 16–16.1 dəq, 98–2% B; 16.1–20 dəq, 2% B. Sütun 40°C-də, nümunə isə 10°C-də avtosamplerdə saxlanılırdı. Axın sürəti 0.3 ml/dəq, inyeksiya həcmi 3 μl idi. Elektrosprey ionlaşma (ESI) mənbəyinə malik Q-Exactive Orbitrap kütlə spektrometri (Thermo Fisher Scientific) tam skan rejimində işlədildi və böyük həcmdə məlumat toplamaq üçün ddMS2 monitorinq rejimi ilə birləşdirildi. MS parametrləri aşağıdakı kimi təyin edildi: sprey gərginliyi +3.8 kV/- 3.2 kV, kapilyar temperatur 320°C, qoruyucu qaz 40 arb, köməkçi qaz 10 arb, zond qızdırıcısının temperaturu 350°C, skanlama diapazonu 70–1050 m/saat, qətnamə 70 000. Məlumatlar Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) istifadə edilərək əldə edildi.
Məlumatların keyfiyyətini qiymətləndirmək üçün hər nümunədən 10 μL supernatant alikvotları çıxarılaraq birləşdirilmiş keyfiyyətə nəzarət (QC) nümunələri yaradıldı. UPLC-MS sisteminin sabitliyini qiymətləndirmək üçün analitik ardıcıllığın əvvəlində altı keyfiyyətə nəzarət nümunəsi inyeksiyası təhlil edildi. Daha sonra keyfiyyətə nəzarət nümunələri vaxtaşırı olaraq partiyaya daxil edilir. Bu tədqiqatda serum nümunələrinin bütün 11 partiyası LC-MS ilə təhlil edildi. Ekstraksiya prosesini izləmək və partiyadan partiyaya təsirləri tənzimləmək üçün müvafiq partiyalarda 100 sağlam donordan alınan serum hovuz qarışığının alikvotları istinad materialı kimi istifadə edildi. Sun Yat-sen Universitetinin Metabolomika Mərkəzində kəşf kohortunun, daxili validasiya kohortunun və xarici validasiya kohortunun hədəflənməmiş metabolomika təhlili aparıldı. Guangdong Texnologiya Universitetinin Təhlil və Sınaq Mərkəzinin xarici laboratoriyası da təsnifatçı modelinin performansını sınaqdan keçirmək üçün xarici kohortdan 40 nümunəni təhlil etdi.
Ekstraksiya və bərpadan sonra, serum metabolitlərinin mütləq miqdarı çoxsaylı reaksiya monitorinqi (MRM) rejimində elektrosprey ionlaşma (ESI) mənbəyi ilə ultra yüksək performanslı maye xromatoqrafiya-tandem kütlə spektrometriyası (Agilent 6495 üçqat kvadrupol) istifadə edilərək ölçüldü. Metabolitləri ayırmaq üçün ACQUITY BEH Amid sütunu (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) istifadə edildi. Mobil faza 10 mmol/L ammonium asetat və 0.1% ammonyak məhlulu ilə 90% (A) və 5% asetonitril (B)-dən ibarət idi. Qradiyent proqramı aşağıdakı kimi idi: 0–1.5 dəq, 0% B; 1.5–6.5 dəq, 0–15% B; 6.5–8 dəq, 15% B; 8–8.5 dəq, 15%-0% B; 8.5–11.5 dəq, 0%B. Sütun avtomatik nümunə götürən cihazda 40 °C, nümunə isə 10 °C-də saxlanıldı. Axın sürəti 0,3 ml/dəq, inyeksiya həcmi isə 1 μL idi. MS parametrləri aşağıdakı kimi təyin edildi: kapilyar gərginlik ±3,5 kV, nebulizer təzyiqi 35 psi, örtük qaz axını 12 L/dəq, örtük qaz temperaturu 350°C, qurutma qazının temperaturu 250°C və qurutma qazının axını 14 l/dəq. Triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin və ksantinin MRM çevrilmələri müvafiq olaraq 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 və 151,0–107,9 təşkil etdi. Məlumatlar Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) istifadə edilərək toplanmışdır. Serum nümunələri üçün triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin və ksantin standart qarışıq məhlullarının kalibrləmə əyrilərindən istifadə etməklə kəmiyyətləndirilmişdir. Hüceyrə nümunələri üçün triptofan tərkibi daxili standarta və hüceyrə zülal kütləsinə normallaşdırılmışdır.
Pik ekstraksiyası (m/z və saxlama müddəti (RT)) Compound Discovery 3.1 və TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) istifadə edilərək həyata keçirildi. Partiyalar arasındakı potensial fərqləri aradan qaldırmaq üçün nisbi bolluq əldə etmək üçün sınaq nümunəsinin hər bir xarakterik zirvəsi eyni partiyadan olan istinad materialının xarakterik zirvəsinə bölündü. Standartlaşdırmadan əvvəl və sonra daxili standartların nisbi standart sapmaları Əlavə Cədvəl 6-da göstərilmişdir. İki qrup arasındakı fərqlər yalançı kəşf dərəcəsi (FDR<0.05, Wilcoxon imzalı rank testi) və qat dəyişikliyi (>1.2 və ya <0.83) ilə xarakterizə edilmişdir. Ekstraksiya edilmiş xüsusiyyətlərin xam MS məlumatları və istinad serumla düzəldilmiş MS məlumatları müvafiq olaraq Əlavə Məlumat 1 və Əlavə Məlumat 2-də göstərilmişdir. Pik annotasiyası müəyyən edilmiş metabolitlər, ehtimal olunan şərhli birləşmələr, ehtimal olunan xarakterizə edilmiş birləşmə sinifləri və naməlum birləşmələr daxil olmaqla dörd müəyyən edilmiş identifikasiya səviyyəsinə əsasən həyata keçirildi 22. Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) verilənlər bazası axtarışlarına əsasən, təsdiqlənmiş standartlara uyğun MS/MS və ya mzCloud (bal > 85) və ya Chemspider-də dəqiq uyğunluq annotasiyalarına malik bioloji birləşmələr nəhayət diferensial metabolom arasında aralıq məhsullar kimi seçildi. Hər bir xüsusiyyət üçün pik annotasiyalar Əlavə Məlumat 3-də yer alır. MetaboAnalyst 5.0 cəm-normallaşdırılmış metabolit bolluğunun tək dəyişkənli təhlili üçün istifadə edilmişdir. MetaboAnalyst 5.0 həmçinin əhəmiyyətli dərəcədə fərqli metabolitlərə əsaslanan KEGG yol zənginləşdirmə analizini qiymətləndirmişdir. Əsas komponent analizi (PCA) və qismən ən kiçik kvadratlar diskriminant analizi (PLS-DA) ropls proqram paketi (v.1.26.4) istifadə edərək yığın normallaşdırması və avtomatik miqyaslama ilə təhlil edilmişdir. Düyün bədxassəliliyini proqnozlaşdırmaq üçün optimal metabolit biomarker modeli ən az mütləq büzülmə və seçim operatoru ilə ikili logistik reqressiya istifadə edilərək yaradılmışdır (LASSO, R paketi v.4.1-3). Diskriminant modelinin aşkarlama və validasiya dəstlərindəki performansı, pROC paketinə (v.1.18.0.) uyğun olaraq ROC analizinə əsaslanan AUC hesablanması ilə xarakterizə edilmişdir. Optimal ehtimal həddi modelin maksimum Youden indeksinə (həssaslıq + spesifiklik – 1) əsasən əldə edilmişdir. Dəyərləri həddən az və ya çox olan nümunələr müvafiq olaraq xoşxassəli düyünlər və ağciyər adenokarsinoması kimi proqnozlaşdırılacaqdır.
A549 hüceyrələri (#CCL-185, Amerika Tipli Mədəniyyət Kolleksiyası) 10% FBS tərkibli F-12K mühitində yetişdirildi. SLC7A5-i hədəf alan qısa saçlı RNT (shRNA) ardıcıllığı və hədəf almayan nəzarət (NC) lentiviral vektor pLKO.1-puro-ya daxil edildi. shSLC7A5-in antisens ardıcıllığı aşağıdakı kimidir: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5-ə (#5347) və tubulinə (#2148) qarşı antitellər Cell Signaling Technology-dən alındı. SLC7A5 və tubulinə qarşı antitellər Western blot analizi üçün 1:1000 nisbətində durulaşdırılaraq istifadə edildi.
Seahorse XF Qlikolitik Stress Testi hüceyrə xarici turşuluq (ECAR) səviyyələrini ölçür. Testdə, ECAR ilə ölçüldüyü kimi hüceyrə qlikolitik tutumunu yoxlamaq üçün ardıcıl olaraq qlükoza, oliqomisin A və 2-DG tətbiq edildi.
Hədəflənməmiş nəzarət (NC) və shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ilə transfeksiya edilmiş A549 hüceyrələri bir gecə ərzində 10 sm diametrli qablarda yerləşdirildi. Hüceyrə metabolitləri 1 ml buz kimi soyuq 80% sulu metanol ilə ekstraksiya edildi. Metanol məhlulundakı hüceyrələr qırıntıdan təmizləndi, yeni bir boruya yığıldı və 4°C-də 15 dəqiqə ərzində 15000 × g-də santrifüj edildi. 800 µl supernatant toplayın və yüksək sürətli vakuum konsentratorundan istifadə edərək qurudun. Qurudulmuş metabolit qranulları daha sonra yuxarıda təsvir edildiyi kimi LC-MS/MS istifadə edərək triptofan səviyyələrinə görə təhlil edildi. A549 hüceyrələrində (NC və shSLC7A5) hüceyrə NAD(H) səviyyələri istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq kəmiyyət NAD+/NADH kolorimetrik dəsti (#K337, BioVision) istifadə edilərək ölçüldü. Metabolitlərin miqdarını normallaşdırmaq üçün hər nümunə üçün zülal səviyyələri ölçüldü.
Nümunə ölçüsünü əvvəlcədən müəyyən etmək üçün heç bir statistik metoddan istifadə edilməmişdir. Biomarker kəşfinə yönəlmiş əvvəlki metabolomika tədqiqatları15,18 ölçünün müəyyən edilməsi üçün etalon kimi qəbul edilmişdir və bu hesabatlarla müqayisədə nümunəmiz adekvat idi. Tədqiqat kohortundan heç bir nümunə xaric edilməmişdir. Hədəfsiz metabolomika tədqiqatları üçün serum nümunələri təsadüfi olaraq kəşf qrupuna (306 hal, 74,6%) və daxili validasiya qrupuna (104 hal, 25,4%) təyin edilmişdir. Həmçinin, hədəf metabolomika tədqiqatları üçün kəşf dəstindən hər qrupdan təsadüfi olaraq 70 hal seçmişik. Tədqiqatçılar LC-MS məlumatlarının toplanması və təhlili zamanı qrup təyinatına məhkum edilmişdilər. Metabolomika məlumatlarının və hüceyrə təcrübələrinin statistik təhlilləri müvafiq Nəticələr, Şəkil Əfsanələri və Metodlar bölmələrində təsvir edilmişdir. Hüceyrə triptofanının, NADT-nin və qlikolitik aktivliyin kəmiyyətləndirilməsi eyni nəticələrlə üç dəfə müstəqil şəkildə aparılmışdır.
Tədqiqat dizaynı haqqında daha çox məlumat üçün bu məqalə ilə əlaqəli Təbii Portfel Hesabatının Xülasəsinə baxın.
Çıxarılan xüsusiyyətlərin xam MS məlumatları və istinad serumunun normallaşdırılmış MS məlumatları müvafiq olaraq Əlavə Məlumat 1 və Əlavə Məlumat 2-də göstərilmişdir. Diferensial xüsusiyyətlər üçün pik annotasiyalar Əlavə Məlumat 3-də təqdim edilmişdir. LUAD TCGA məlumat dəstini https://portal.gdc.cancer.gov/ saytından yükləmək olar. Qrafik çəkmək üçün giriş məlumatları mənbə məlumatlarında verilmişdir. Mənbə məlumatları bu məqalə üçün təqdim edilmişdir.
Milli Ağciyər Skrininq Tədqiqat Qrupu və s. Aşağı dozalı kompüter tomoqrafiyası ilə ağciyər xərçəngi ölümünün azaldılması. Şimali İngiltərə. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR və Prophet, PC Aşağı dozalı spiral KT istifadə edərək ağciyər xərçəngi skrininqi: Milli Ağciyər Skrininq Tədqiqatının (NLST) nəticələri. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ və b. Randomizə edilmiş sınaqda həcmli KT müayinəsi ilə ağciyər xərçəngindən ölüm hallarının azaldılması. Şimali İngiltərə. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Yazı vaxtı: 18 sentyabr 2023