Kompüter tomoqrafiyası (KT) ilə müəyyən edilmiş ağciyər düyünlərinin differensial diaqnostikası klinik praktikada problem olaraq qalır.Burada sağlam nəzarət, xoşxassəli ağciyər düyünləri və I mərhələ ağciyər adenokarsinoması daxil olmaqla 480 serum nümunəsinin qlobal metabolomunu xarakterizə edirik.Adenokarsinomalar unikal metabolik profillər nümayiş etdirir, halbuki xoşxassəli düyünlər və sağlam fərdlər metabolomik profillərdə yüksək oxşarlığa malikdirlər.Kəşf qrupunda (n = 306) xoşxassəli və bədxassəli düyünləri fərqləndirmək üçün 27 metabolitdən ibarət bir sıra müəyyən edilmişdir.Daxili qiymətləndirmə (n = 104) və xarici qiymətləndirmə (n = 111) qruplarında diskriminant modelinin AUC-u müvafiq olaraq 0,915 və 0,945 olmuşdur.Yolun təhlili xoşxassəli düyünlər və sağlam nəzarətlərlə müqayisədə ağciyər adenokarsinoması serumunda azalmış triptofanın artması ilə əlaqəli artan qlikolitik metabolitləri aşkar etdi və triptofanın qəbulunun ağciyər xərçəngi hüceyrələrində qlikolizi təşviq etdiyini irəli sürdü.Tədqiqatımız KT ilə aşkar edilən ağciyər düyünlərinin riskinin qiymətləndirilməsində serum metabolit biomarkerlərinin dəyərini vurğulayır.
Erkən diaqnoz xərçəng xəstələrinin sağ qalma nisbətlərini yaxşılaşdırmaq üçün vacibdir.ABŞ Milli Ağciyər Xərçəngi Skrininq Sınaqının (NLST) və Avropa NELSON Tədqiqatının nəticələri göstərdi ki, aşağı dozalı kompüter tomoqrafiyası (LDCT) ilə skrininq yüksək risk qruplarında ağciyər xərçəngindən ölüm hallarını əhəmiyyətli dərəcədə azalda bilər1,2,3.Ağciyər xərçənginin skrininqi üçün LDCT-nin geniş yayılmasından bəri, asimptomatik ağciyər düyünlərinin təsadüfi rentgenoqrafik tapıntılarının tezliyi artmaqda davam etmişdir 4 .Ağciyər nodülləri diametri 3 sm-ə qədər olan fokus şəffaflığı kimi müəyyən edilir 5 .Biz bədxassəli şişlərin ehtimalını qiymətləndirməkdə və LDCT-də təsadüfən aşkar edilmiş çoxlu sayda ağciyər düyünləri ilə mübarizə aparmaqda çətinliklərlə üzləşirik.KT-nin məhdudiyyətləri tez-tez təkrar müayinələrə və yanlış müsbət nəticələrə gətirib çıxara bilər, bu da lazımsız müdaxiləyə və həddindən artıq müalicəyə səbəb ola bilər6.Buna görə də, erkən mərhələdə ağciyər xərçəngini düzgün müəyyən etmək və ilkin aşkarlamada ən xoşxassəli düyünləri fərqləndirmək üçün etibarlı və faydalı biomarkerlərin hazırlanmasına ehtiyac var 7 .
Qanın hərtərəfli molekulyar analizi (serum, plazma, periferik qanın mononükleer hüceyrələri), o cümlədən genomika, proteomika və ya DNT metilasiyası8,9,10 ağciyər xərçəngi üçün diaqnostik biomarkerlərin kəşfinə marağın artmasına səbəb olmuşdur.Eyni zamanda, metabolomik yanaşmalar endogen və ekzogen təsirlərdən təsirlənən hüceyrə son məhsulları ölçür və buna görə də xəstəliyin başlanğıcını və nəticəsini proqnozlaşdırmaq üçün tətbiq olunur.Maye xromatoqrafiya-tandem kütlə spektrometriyası (LC-MS) müxtəlif fiziki-kimyəvi xassələrə malik metabolitləri əhatə edə bilən yüksək həssaslığına və geniş dinamik diapazonuna görə metabolomik tədqiqatlar üçün geniş istifadə olunan üsuldur11,12,13.Plazma/zərdabın qlobal metabolomik analizi ağciyər xərçəngi diaqnozu14,15,16,17 və müalicənin effektivliyi ilə əlaqəli biomarkerləri müəyyən etmək üçün istifadə olunsa da, yaxşı və bədxassəli ağciyər düyünlərini ayırd etmək üçün 18 serum metabolit təsnifatçıları hələ də çox öyrənilməlidir.- kütləvi tədqiqat.
Adenokarsinoma və skuamöz hüceyrəli karsinoma kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçənginin (KHDAK) iki əsas alt növüdür.Müxtəlif CT skrininq testləri adenokarsinomanın ağciyər xərçənginin ən çox görülən histoloji növü olduğunu göstərir1,19,20,21.Bu işdə sağlam nəzarətlər, xoşxassəli ağciyər düyünləri və CT-də aşkar edilmiş ≤3 sm daxil olmaqla cəmi 695 serum nümunəsi üzərində metabolomik analiz aparmaq üçün ultra-performanslı maye xromatoqrafiya-yüksək ayırdetmə kütlə spektrometriyasından (UPLC-HRMS) istifadə etdik.Mərhələ I ağciyər adenokarsinoması üçün skrininq.Ağciyər adenokarsinomasını xoşxassəli düyünlərdən və sağlam nəzarətdən fərqləndirən serum metabolitləri panelini müəyyən etdik.Yolun zənginləşdirilməsi təhlili aşkar etdi ki, anormal triptofan və qlükoza metabolizmi xoşxassəli düyünlər və sağlam nəzarət ilə müqayisədə ağciyər adenokarsinomasında ümumi dəyişikliklərdir.Nəhayət, biz LDCT tərəfindən aşkar edilən bədxassəli və xoşxassəli ağciyər düyünlərini ayırd etmək üçün yüksək spesifikliyə və həssaslığa malik zərdab metabolik təsnifatını qurduq və təsdiq etdik ki, bu da erkən diferensial diaqnoz və riskin qiymətləndirilməsinə kömək edə bilər.
Cari tədqiqatda 174 sağlam nəzarətdən, xoşxassəli ağciyər düyünləri olan 292 xəstədən və I mərhələ ağciyər adenokarsinoması olan 229 xəstədən cins və yaşa uyğun serum nümunələri retrospektiv şəkildə toplanmışdır.695 subyektin demoqrafik xüsusiyyətləri Əlavə Cədvəl 1-də göstərilmişdir.
Şəkil 1a-da göstərildiyi kimi, Sun Yat-sen Universitetinin Xərçəng Mərkəzində 174 sağlam nəzarət (HC), 170 xoşxassəli düyün (BN) və 136 I mərhələdə ağciyər adenokarsinoması (LA) daxil olmaqla cəmi 480 serum nümunəsi toplanmışdır.Ultra-performanslı maye xromatoqrafiya-yüksək ayırdetmə kütlə spektrometriyasından (UPLC-HRMS) istifadə edərək hədəfsiz metabolomik profilləşdirmə üçün kəşf kohortu.Əlavə Şəkil 1-də göstərildiyi kimi, LA və HC, LA və BN arasında diferensial metabolitlər təsnifat modelini yaratmaq və diferensial yol analizini daha da araşdırmaq üçün müəyyən edilmişdir.Sun Yat-sen Universitetinin Xərçəng Mərkəzi tərəfindən toplanmış 104 nümunə və digər iki xəstəxana tərəfindən toplanmış 111 nümunə müvafiq olaraq daxili və xarici yoxlamaya məruz qalmışdır.
Ultra-performanslı maye xromatoqrafiya-yüksək ayırdetmə kütlə spektrometriyasından (UPLC-HRMS) istifadə edərək qlobal serum metabolomik analizindən keçən kəşf kohortunda tədqiqat populyasiyası.b Sağlam nəzarət (HC, n = 174), xoşxassəli düyünlər (BN, n = 170) və I mərhələ ağciyər adenokarsinoması daxil olmaqla, tədqiqat kohortundan 480 serum nümunəsinin ümumi metabolomunun qismən ən kiçik kvadratlar diskriminant analizi (PLS-DA) (Los Angeles, n = 136).+ESI, müsbət elektrosprey ionlaşma rejimi, -ESI, mənfi elektrosprey ionlaşma rejimi.c–e Verilmiş iki qrupda əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bolluğa malik metabolitlər (iki quyruqlu Wilcoxon işarəli rütbə testi, yalançı kəşf dərəcəsi tənzimlənən p dəyəri, FDR <0,05) qırmızı (qat dəyişmə > 1,2) və mavi (qat dəyişmə < 0,83) rənglərlə göstərilmişdir. .) vulkan qrafikində göstərilmişdir.f LA və BN arasında şərh edilmiş metabolitlərin sayında əhəmiyyətli fərqləri göstərən iyerarxik qruplaşma istilik xəritəsi.Mənbə məlumatları mənbə məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Kəşf qrupunda 174 HC, 170 BN və 136 LA ümumi serum metabolomu UPLC-HRMS analizindən istifadə edərək təhlil edilmişdir.Biz əvvəlcə göstəririk ki, keyfiyyətə nəzarət (QC) nümunələri nəzarətsiz əsas komponent analizi (PCA) modelinin mərkəzində sıx birləşir və bu, cari tədqiqatın performansının sabitliyini təsdiqləyir (Əlavə Şəkil 2).
Şəkil 1 b-də qismən ən kiçik kvadratlar-diskriminant analizində (PLS-DA) göstərildiyi kimi, müsbət (+ESI) və mənfi (−ESI) elektrosprey ionlaşma rejimlərində LA və BN, LA və HC arasında aydın fərqlərin olduğunu aşkar etdik. .təcrid olunmuş.Bununla belə, +ESI və -ESI şərtlərində BN və HC arasında əhəmiyyətli fərqlər aşkar edilməmişdir.
Biz LA və HC arasında 382 diferensial xüsusiyyət, LA və BN arasında 231 diferensial xüsusiyyət və BN və HC arasında 95 diferensial xüsusiyyət tapdıq (Wilcoxon imzalı dərəcə testi, FDR <0.05 və çoxsaylı dəyişiklik >1.2 və ya <0.83) (Şəkil .1c-e) )..Piklər əlavə olaraq (Əlavə Məlumat 3) verilənlər bazasına (mzCloud/HMDB/Chemspider kitabxanası) qarşı m/z dəyəri, saxlama müddəti və parçalanma kütlə spektrinin axtarışı (təfsilatlar Metodlar bölməsində təsvir edilmişdir) 22 ilə qeyd edilmişdir.Nəhayət, BN-yə qarşı LA (Şəkil 1f və Əlavə Cədvəl 2) və HC-yə qarşı LA (Əlavə Şəkil 3 və Əlavə Cədvəl 2) üçün bolluq baxımından əhəmiyyətli fərqləri olan 33 və 38 şərh edilmiş metabolitlər müəyyən edilmişdir.Bunun əksinə olaraq, PLS-DA-da BN və HC arasındakı üst-üstə düşməyə uyğun olaraq, BN və HC-də bolluq baxımından əhəmiyyətli fərqləri olan yalnız 3 metabolit müəyyən edilmişdir (Əlavə Cədvəl 2).Bu diferensial metabolitlər biokimyəvi maddələrin geniş spektrini əhatə edir (Əlavə Şəkil 4).Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr yaxşı xassəli ağciyər düyünləri və ya sağlam subyektlərlə müqayisədə erkən mərhələdə ağciyər xərçənginin bədxassəli transformasiyasını əks etdirən serum metabolomunda əhəmiyyətli dəyişiklikləri nümayiş etdirir.Eyni zamanda, BN və HC-nin serum metabolomunun oxşarlığı, xoşxassəli ağciyər düyünlərinin sağlam insanlarla bir çox bioloji xüsusiyyətləri paylaşa biləcəyini göstərir.Epidermal böyümə faktoru reseptoru (EGFR) gen mutasiyalarının ağciyər adenokarsinoma alt növü 23-də ümumi olduğunu nəzərə alaraq, biz sürücü mutasiyalarının serum metabolomuna təsirini müəyyən etməyə çalışdıq.Daha sonra ağciyər adenokarsinoması qrupunda EGFR statusu olan 72 hadisənin ümumi metabolomik profilini təhlil etdik.Maraqlıdır ki, biz PCA analizində EGFR mutant xəstələri (n = 41) və EGFR vəhşi tipli xəstələr (n = 31) arasında müqayisə edilə bilən profillər tapdıq (Əlavə Şəkil 5a).Bununla belə, EGFR mutasiyası olan xəstələrdə bolluğu vəhşi tip EGFR olan xəstələrlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş 7 metabolit müəyyən etdik (t testi, p <0.05 və qat dəyişməsi > 1.2 və ya <0.83) (Əlavə Şəkil 5b).Bu metabolitlərin əksəriyyəti (7-dən 5-i) yağ turşularının oksidləşmə yollarında mühüm rol oynayan asilkarnitinlərdir.
Şəkil 2 a-da göstərilən iş prosesində göstərildiyi kimi, düyünlərin təsnifatı üçün biomarkerlər ən az mütləq daralma operatorları və LA (n = 136) və BN (n = 170) müəyyən edilmiş 33 diferensial metabolit əsasında seçim əsasında əldə edilmişdir.Dəyişənlərin ən yaxşı birləşməsi (LASSO) – ikili logistik reqressiya modeli.Modelin etibarlılığını yoxlamaq üçün on qat çarpaz doğrulamadan istifadə edilmişdir.Dəyişənlərin seçilməsi və parametrlərin nizamlanması λ24 parametri ilə ehtimal maksimumlaşdırma cəzası ilə tənzimlənir.Qlobal metabolomik təhlil daha sonra ayrı-seçkilik modelinin təsnifat performansını yoxlamaq üçün daxili qiymətləndirmə (n = 104) və xarici qiymətləndirmə (n = 111) qruplarında müstəqil olaraq həyata keçirildi.Nəticədə, kəşf dəstindəki 27 metabolit ən böyük orta AUC dəyərinə malik ən yaxşı diskriminant model kimi müəyyən edildi (Şəkil 2b), bunlardan 9-da BN ilə müqayisədə LA-da aktivlik artdı və 18-də aktivlik azaldı (Şəkil 2c).
Onqat çarpaz doğrulama vasitəsilə ikili logistik reqressiya modelindən istifadə edərək kəşf dəstində serum metabolitlərinin ən yaxşı panelinin seçilməsi və daxili və xarici yoxlama dəstlərində proqnozlaşdırıcı performansın qiymətləndirilməsi daxil olmaqla, ağciyər nodül təsnifatının qurulması üçün iş axını.b Metabolik biomarker seçimi üçün LASSO reqressiya modelinin çarpaz doğrulama statistikası.Yuxarıda verilmiş rəqəmlər verilmiş λ-da seçilmiş biomarkerlərin orta sayını əks etdirir.Qırmızı nöqtəli xətt müvafiq lambdada orta AUC dəyərini təmsil edir.Boz xəta çubuqları minimum və maksimum AUC dəyərlərini təmsil edir.Nöqtəli xətt seçilmiş 27 biomarkerlə ən yaxşı modeli göstərir.AUC, qəbuledicinin işləmə xarakteristikasının (ROC) əyrisi altındakı sahə.c Kəşf qrupunda BN qrupu ilə müqayisədə LA qrupunda 27 seçilmiş metabolitdə dəyişiklikləri qatlayın.Qırmızı sütun - aktivləşdirmə.Mavi sütun enişdir.d–f Kəşf, daxili və xarici yoxlama dəstlərində 27 metabolit birləşməsinə əsaslanan diskriminant modelin gücünü göstərən qəbuledicinin işləmə xarakteristikasının (ROC) əyriləri.Mənbə məlumatları mənbə məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Bu 27 metabolitin çəkili reqressiya əmsallarına əsasən proqnozlaşdırma modeli yaradılmışdır (Əlavə Cədvəl 3).Bu 27 metabolit əsasında ROC analizi əyri altındakı sahə (AUC) dəyəri 0,933, kəşf qrupunun həssaslığı 0,868, spesifiklik isə 0,859 (Şəkil 2d) verdi.Eyni zamanda, LA və HC arasındakı 38 şərh edilmiş diferensial metabolit arasında 16 metabolit dəsti LA-nı HC-dən ayırmaqda 0,801 həssaslıq və 0,856 spesifiklik ilə 0,902 AUC əldə etdi (Əlavə Şəkil 6a-c).Diferensial metabolitlər üçün müxtəlif qat dəyişmə hədlərinə əsaslanan AUC dəyərləri də müqayisə edilmişdir.Təsnifat modelinin LA və BN (HC) arasında fərq qoymada ən yaxşı nəticə verdiyini aşkar etdik ki, qat dəyişmə səviyyəsi 1,5 və ya 2,0-a qarşı 1,2-yə təyin olundu (Əlavə Şəkil 7a, b).27 metabolit qrupuna əsaslanan təsnifat modeli daxili və xarici kohortlarda daha da təsdiq edilmişdir.Daxili qiymətləndirmə üçün AUC 0,915 (həssaslıq 0,867, spesifiklik 0,811) və xarici yoxlama üçün 0,945 (həssaslıq 0,810, spesifiklik 0,979) təşkil etmişdir (Şəkil 2e, f).Laboratoriyalararası səmərəliliyi qiymətləndirmək üçün xarici kohortdan 40 nümunə Metodlar bölməsində təsvir olunduğu kimi xarici laboratoriyada təhlil edilmişdir.Təsnifat dəqiqliyi 0,925 AUC əldə etdi (Əlavə Şəkil 8).Ağciyər skuamöz hüceyrəli karsinoması (LUSC) ağciyər adenokarsinomasından (LUAD) sonra kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçənginin (QHDAK) ikinci ən çox yayılmış alt növü olduğundan, biz metabolik profillərin təsdiqlənmiş potensial faydasını da sınaqdan keçirdik.BN və 16 LUSC hadisəsi.LUSC və BN arasındakı ayrı-seçkiliyin AUC dəyəri 0,776 (Əlavə Şəkil 9) idi, bu, LUAD və BN arasındakı ayrı-seçkiliklə müqayisədə daha zəif qabiliyyəti göstərir.
Tədqiqatlar göstərdi ki, KT görüntülərində düyünlərin ölçüsü bədxassəli şişlərin yaranma ehtimalı ilə müsbət əlaqədədir və düyünlərin müalicəsinin əsas determinantı olaraq qalır25,26,27.NELSON skrininq tədqiqatının böyük kohortundan alınan məlumatların təhlili göstərdi ki, düyünləri <5 mm olan subyektlərdə bədxassəli şiş riski hətta düyünləri olmayan subyektlərdəki ilə oxşardır 28 .Buna görə də, müntəzəm KT monitorinqini tələb edən minimum ölçü Britaniya Torakal Cəmiyyəti (BTS) tərəfindən tövsiyə edildiyi kimi 5 mm və Fleischner Cəmiyyəti tərəfindən tövsiyə edildiyi kimi 6 mm-dir 29 .Bununla belə, 6 mm-dən böyük və aşkar xoşxassəli xüsusiyyətləri olmayan, qeyri-müəyyən ağciyər düyünləri (IPN) adlanan düyünlər klinik praktikada qiymətləndirmə və idarəetmədə əsas problem olaraq qalır30,31.Daha sonra kəşf və daxili yoxlama kohortlarından yığılmış nümunələrdən istifadə edərək düyün ölçüsünün metabolomik imzalara təsir edib-etmədiyini araşdırdıq.27 təsdiqlənmiş biomarkerə diqqət yetirərək, biz əvvəlcə HC və BN sub-6 mm metabolomların PCA profillərini müqayisə etdik.HC və BN üçün məlumat nöqtələrinin əksəriyyətinin üst-üstə düşdüyünü, serum metabolit səviyyələrinin hər iki qrupda oxşar olduğunu nümayiş etdirdiyini gördük (Şəkil 3a).Müxtəlif ölçülü diapazonlardakı xüsusiyyət xəritələri BN və LA-da qorunub saxlanıldı (Şəkil 3b, c), halbuki 6-20 mm diapazonda bədxassəli və xoşxassəli düyünlər arasında bir ayrılıq müşahidə edildi (Şəkil 3d).Bu kohortun AUC 0,927, spesifikliyi 0,868 və 6 ilə 20 mm ölçülü düyünlərin bədxassəliliyini proqnozlaşdırmaq üçün həssaslıq 0,820 idi (Şəkil 3e, f).Nəticələrimiz göstərir ki, təsnifat düyün ölçüsündən asılı olmayaraq erkən bədxassəli transformasiya nəticəsində yaranan metabolik dəyişiklikləri ələ keçirə bilir.
ad 27 metabolitdən ibarət metabolik təsnifata əsaslanan müəyyən qruplar arasında PCA profillərinin müqayisəsi.CC və BN < 6 mm.b BN < 6 mm və BN 6-20 mm.LA-da 6–20 mm, LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm və LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6-20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e 6–20 mm nodüllər üçün diskriminant model performansını göstərən qəbuledicinin işləmə xarakteristikasının (ROC) əyrisi.f Ehtimal dəyərləri 6-20 mm ölçülü nodüllər üçün logistik reqressiya modelinə əsasən hesablanmışdır.Boz nöqtəli xətt optimal kəsmə dəyərini (0,455) təmsil edir.Yuxarıdakı rəqəmlər Los Anceles üçün proqnozlaşdırılan işlərin faizini əks etdirir.İki quyruqlu Tələbənin t testindən istifadə edin.PCA, əsas komponent analizi.Əyri altındakı AUC sahəsi.Mənbə məlumatları mənbə məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Təklif olunan bədxassəli şişlərin proqnozlaşdırılması modelinin performansını göstərmək üçün oxşar ağciyər nodül ölçüləri (7-9 mm) olan dörd nümunə (44-61 yaş) daha sonra seçilmişdir (Şəkil 4a, b).İlkin skrininq zamanı 1-ci hal xoş xasiyyətlə əlaqəli olan kalsifikasiyalı bərk düyün kimi təqdim olundu, halbuki 2-ci hal aşkar xoşxassəli xüsusiyyətləri olmayan qeyri-müəyyən qismən bərk düyün kimi təqdim edildi.Üç raund təqib CT taramaları göstərdi ki, bu hallar 4 il ərzində sabit qalıb və buna görə də xoşxassəli düyünlər hesab edilir (Şəkil 4a).Serial CT taramalarının klinik qiymətləndirilməsi ilə müqayisədə, cari təsnifat modeli ilə tək atışlı serum metabolit analizi ehtimal məhdudiyyətlərinə əsaslanaraq bu xoşxassəli düyünləri tez və düzgün müəyyənləşdirdi (Cədvəl 1).Şəkil 4b 3-də plevral geri çəkilmə əlamətləri olan düyün göstərilir və bu, ən çox bədxassəli şişlərlə əlaqələndirilir32.4-cü hal xoşxassəli səbəbin sübutu olmayan qeyri-müəyyən qismən bərk düyün kimi təqdim edilmişdir.Bütün bu hallar təsnifat modelinə əsasən bədxassəli kimi proqnozlaşdırılıb (Cədvəl 1).Ağciyər adenokarsinomasının qiymətləndirilməsi ağciyər rezeksiyası əməliyyatından sonra histopatoloji müayinə ilə nümayiş etdirildi (Şəkil 4b).Xarici qiymətləndirmə dəsti üçün metabolik təsnifat 6 mm-dən böyük qeyri-müəyyən ağciyər nodüllərinin iki halını dəqiq proqnozlaşdırdı (Əlavə Şəkil 10).
İki xoşxassəli düyün halının ağciyərlərinin eksenel pəncərəsinin CT şəkilləri.1-ci halda, 4 ildən sonra KT müayinəsi sağ alt lobda kalsifikasiya ilə 7 mm ölçülü sabit bərk düyün göstərdi.2-ci halda, 5 ildən sonra CT-də sağ yuxarı lobda 7 mm diametrli stabil, qismən bərk düyün aşkar edildi.b Ağciyərlərin eksenel pəncərə CT şəkilləri və ağciyər rezeksiyasından əvvəl I mərhələ adenokarsinomasının iki halının müvafiq patoloji tədqiqatları.3-cü halda sağ üst lobda 8 mm diametrli plevral çəkilmə ilə düyün aşkar edildi.4-cü halda sol yuxarı lobda 9 mm ölçülü qismən bərk daş şüşəli düyün aşkar edilmişdir.Rezeke edilmiş ağciyər toxumasının hematoksilin və eozin (H&E) ilə boyanması (miqyas çubuğu = 50 μm) ağciyər adenokarsinomasının asinar böyümə modelini nümayiş etdirir.Oklar CT şəkillərində aşkar edilmiş düyünləri göstərir.H&E şəkilləri patoloq tərəfindən araşdırılan çoxlu (>3) mikroskopik sahənin reprezentativ şəkilləridir.
Birlikdə götürdükdə, əldə etdiyimiz nəticələr ağciyər düyünlərinin differensial diaqnostikasında serum metabolit biomarkerlərinin potensial dəyərini nümayiş etdirir ki, bu da KT skrininqini qiymətləndirərkən çətinliklər yarada bilər.
Təsdiqlənmiş diferensial metabolit panelinə əsaslanaraq, biz əsas metabolik dəyişikliklərin bioloji korrelyasiyasını müəyyən etməyə çalışdıq.MetaboAnalyst tərəfindən KEGG yolunun zənginləşdirilməsi təhlili iki verilmiş qrup arasında 6 ümumi əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş yolu müəyyən etdi (LA vs HC və LA vs BN, düzəliş edilmiş p ≤ 0,001, effekt > 0,01).Bu dəyişikliklər piruvat mübadiləsində, triptofan metabolizmində, niasin və nikotinamid metabolizmində, qlikolizdə, TCA siklində və purin mübadiləsində pozğunluqlarla xarakterizə olunurdu (Şəkil 5a).Daha sonra mütləq kəmiyyətdən istifadə edərək əsas dəyişiklikləri yoxlamaq üçün hədəflənmiş metabolomiyalar həyata keçirdik.Əsl metabolit standartlarından istifadə etməklə üçlü dördqütblü kütlə spektrometriyası (QQQ) ilə ümumi dəyişdirilmiş yollarda ümumi metabolitlərin təyini.Metabolomik tədqiqatın hədəf nümunəsinin demoqrafik xüsusiyyətləri Əlavə Cədvəl 4-ə daxil edilmişdir. Qlobal metabolomik nəticələrimizə uyğun olaraq, kəmiyyət təhlili BN və HC ilə müqayisədə LA-da hipoksantin və ksantin, piruvat və laktatın artdığını təsdiqlədi (Şəkil 5b, c, p <0,05).Bununla belə, BN və HC arasında bu metabolitlərdə əhəmiyyətli fərqlər aşkar edilməmişdir.
BN və HC qrupları ilə müqayisədə LA qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə fərqli metabolitlərin KEGG yolunun zənginləşdirilməsi təhlili.İki quyruqlu Globaltest istifadə edildi və p dəyərləri Holm-Bonferroni metodundan istifadə edərək düzəldildi (tənzimlənmiş p ≤ 0.001 və təsir ölçüsü > 0.01).b–d LC-MS/MS ilə müəyyən edilmiş serum HC, BN və LA-da hipoksantin, ksantin, laktat, piruvat və triptofan səviyyələrini göstərən skripka planları (qrup başına n = 70).Ağ və qara nöqtəli xətlər müvafiq olaraq medianı və kvartili göstərir.e LUAD-TCGA verilənlər bazasında normal ağciyər toxuması (n = 59) ilə müqayisədə ağciyər adenokarsinomasında (n = 513) SLC7A5 və QPRT-nin normallaşdırılmış Log2TPM (milyonda transkript) mRNA ifadəsini göstərən skripka planı.Ağ qutu kvartallararası diapazonu, mərkəzdəki üfüqi qara xətt medianı, qutudan uzanan şaquli qara xətt isə 95% etibarlılıq intervalını (CI) təmsil edir.f TCGA verilənlər bazasında ağciyər adenokarsinomasında (n = 513) və normal ağciyər toxumasında (n = 59) SLC7A5 və GAPDH ifadəsinin Pearson korrelyasiya planı.Boz sahə 95% CI-ni təmsil edir.r, Pearson korrelyasiya əmsalı.g LC-MS/MS tərəfindən təyin olunmuş qeyri-spesifik shRNA nəzarəti (NC) və shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ilə transfeksiya edilmiş A549 hüceyrələrində normallaşdırılmış hüceyrə triptofan səviyyələri.Hər qrupda beş bioloji cəhətdən müstəqil nümunənin statistik təhlili təqdim olunur.h A549 hüceyrələrində (NC) və SLC7A5 yıxılan A549 hüceyrələrində (Sh1, Sh2) NADt (ümumi NAD, NAD+ və NADH daxil olmaqla) hüceyrə səviyyələri.Hər qrupda bioloji cəhətdən müstəqil üç nümunənin statistik təhlili təqdim olunur.i SLC7A5 yıxılmadan əvvəl və sonra A549 hüceyrələrinin qlikolitik aktivliyi hüceyrədənkənar turşulaşma dərəcəsi (ECAR) ilə ölçüldü (hər qrup üçün n = 4 bioloji cəhətdən müstəqil nümunə).2-DG,2-deoksi-D-qlükoza.İki quyruqlu Tələbənin t testindən (b-h) istifadə edilmişdir.(g–i) bəndində xəta çubuqları orta ± SD-ni təmsil edir, hər bir təcrübə üç dəfə müstəqil olaraq həyata keçirilmiş və nəticələr oxşar olmuşdur.Mənbə məlumatları mənbə məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
LA qrupunda dəyişdirilmiş triptofan metabolizminin əhəmiyyətli təsirini nəzərə alaraq, QQQ istifadə edərək HC, BN və LA qruplarında serum triptofan səviyyələrini də qiymətləndirdik.Serum triptofanın HC və ya BN ilə müqayisədə LA-da azaldığını aşkar etdik (p <0.001, Şəkil 5d), bu, dövran edən triptofan səviyyələrinin ağciyər xərçəngi olan xəstələrdə nəzarət qrupundan sağlam nəzarət edənlərə nisbətən daha aşağı olması ilə bağlı əvvəlki tapıntılara uyğundur33,34 ,35.PET/CT izləyicisi 11C-metil-L-triptofandan istifadə edən başqa bir araşdırma, ağciyər xərçəngi toxumasında triptofan siqnalının saxlanma müddətinin xoşxassəli lezyonlar və ya normal toxuma ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artdığını aşkar etdi36.Biz fərz edirik ki, LA serumunda triptofanın azalması ağciyər xərçəngi hüceyrələri tərəfindən aktiv triptofanın qəbulunu əks etdirə bilər.
Həmçinin məlumdur ki, triptofan katabolizminin kinurenin yolunun son məhsulu NAD+37,38-dir ki, bu da qlikolizdə qliseraldehid-3-fosfatın 1,3-bifosfogliserat ilə reaksiyası üçün mühüm substratdır39.Əvvəlki tədqiqatlar immunitetin tənzimlənməsində triptofan katabolizminin roluna diqqət yetirsə də, biz hazırkı işdə müşahidə olunan triptofan disregulyasiyası və qlikolitik yollar arasındakı qarşılıqlı əlaqəni aydınlaşdırmağa çalışdıq.Məhlul daşıyıcı ailənin 7 üzvü 5 (SLC7A5) triptofan daşıyıcısı olduğu bilinir43,44,45.Xinolin turşusu fosforiboziltransferaza (QPRT) kinolin turşusunu NAMN46-ya çevirən kinurenin yolunun aşağı axınında yerləşən bir fermentdir.LUAD TCGA məlumat dəstinin təftişi, həm SLC7A5, həm də QPRT-nin normal toxuma ilə müqayisədə şiş toxumasında əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimləndiyini aşkar etdi (Şəkil 5e).Bu artım I və II mərhələlərdə, eləcə də ağciyər adenokarsinomasının III və IV mərhələlərində müşahidə edildi (Əlavə Şəkil 11), bu, şişlərin əmələ gəlməsi ilə əlaqəli triptofan mübadiləsində erkən pozğunluqları göstərir.
Əlavə olaraq, LUAD-TCGA məlumat dəsti xərçəng xəstəsi nümunələrində SLC7A5 və GAPDH mRNA ifadəsi arasında müsbət korrelyasiya göstərdi (r = 0.45, p = 1.55E-26, Şəkil 5f).Bunun əksinə olaraq, normal ağciyər toxumasında belə gen imzaları arasında heç bir əhəmiyyətli korrelyasiya tapılmadı (r = 0.25, p = 0.06, Şəkil 5f).A549 hüceyrələrində SLC7A5-in (Əlavə Şəkil 12) yıxılması hüceyrə triptofan və NAD(H) səviyyələrini (Şəkil 5g,h) əhəmiyyətli dərəcədə azaldır, nəticədə hüceyrədənkənar turşulaşma dərəcəsi (ECAR) ilə ölçülən zəifləmiş qlikolitik aktivliyə səbəb olur (Şəkil 1).5i).Beləliklə, serumda metabolik dəyişikliklərə və in vitro aşkarlanmasına əsaslanaraq, biz fərz edirik ki, triptofan metabolizmi kinurenin yolu ilə NAD+ yarada bilər və ağciyər xərçəngində qlikolizin təşviqində mühüm rol oynaya bilər.
Tədqiqatlar göstərmişdir ki, LDCT tərəfindən aşkar edilən çoxlu sayda qeyri-müəyyən ağciyər düyünləri bədxassəli şişin yalan-müsbət diaqnozu səbəbindən PET-CT, ağciyər biopsiyası və həddindən artıq müalicə kimi əlavə testlərə ehtiyaca səbəb ola bilər.31 Şəkil 6-da göstərildiyi kimi, tədqiqatımız potensial diaqnostik dəyərə malik zərdab metabolitləri panelini müəyyən etdi ki, bu da risk təbəqələşməsini və KT ilə aşkar edilən ağciyər düyünlərinin sonrakı idarə olunmasını yaxşılaşdıra bilər.
Ağciyər düyünləri yaxşı və ya bədxassəli səbəbləri göstərən görüntüləmə xüsusiyyətləri ilə aşağı dozalı kompüter tomoqrafiyası (LDCT) istifadə edərək qiymətləndirilir.Nodüllərin qeyri-müəyyən nəticəsi tez-tez təqib ziyarətlərinə, lazımsız müdaxilələrə və həddindən artıq müalicəyə səbəb ola bilər.Diaqnostik əhəmiyyəti olan serum metabolik təsnifatçılarının daxil edilməsi riskin qiymətləndirilməsini və ağciyər düyünlərinin sonrakı idarə edilməsini yaxşılaşdıra bilər.PET pozitron emissiya tomoqrafiyası.
ABŞ NLST tədqiqatından və Avropa NELSON tədqiqatından əldə edilən məlumatlar göstərir ki, yüksək riskli qrupların aşağı dozalı kompüter tomoqrafiyası (LDCT) ilə skrininqi ağciyər xərçəngindən ölüm hallarını azalda bilər1,3.Bununla belə, LDCT tərəfindən aşkar edilən çoxlu sayda təsadüfi ağciyər nodüllərinin risk qiymətləndirilməsi və sonrakı kliniki idarə olunması ən çətin məsələ olaraq qalır.Əsas məqsəd etibarlı biomarkerləri daxil etməklə mövcud LDCT əsaslı protokolların düzgün təsnifatını optimallaşdırmaqdır.
Qan metabolitləri kimi bəzi molekulyar biomarkerlər ağciyər xərçəngini sağlam nəzarətlə müqayisə etməklə müəyyən edilmişdir15,17.Hazırkı tədqiqatda biz LDCT ilə təsadüfən aşkar edilmiş xoşxassəli və bədxassəli ağciyər düyünlərini ayırd etmək üçün serum metabolomik analizinin tətbiqinə diqqət yetirdik.UPLC-HRMS analizindən istifadə edərək sağlam nəzarət (HC), xoşxassəli ağciyər düyünləri (BN) və I mərhələ ağciyər adenokarsinoması (LA) nümunələrinin qlobal serum metabolomunu müqayisə etdik.HC və BN-nin oxşar metabolik profillərə malik olduğunu, LA-nın isə HC və BN ilə müqayisədə əhəmiyyətli dəyişikliklər göstərdiyini gördük.LA-nı HC və BN-dən fərqləndirən iki serum metabolit dəsti müəyyən etdik.
Benign və bədxassəli düyünlər üçün mövcud LDCT əsaslı identifikasiya sxemi əsasən düyünlərin ölçüsünə, sıxlığına, morfologiyasına və zamanla böyümə sürətinə əsaslanır30.Əvvəlki tədqiqatlar düyünlərin ölçüsünün ağciyər xərçəngi ehtimalı ilə sıx əlaqəli olduğunu göstərdi.Yüksək riskli xəstələrdə belə, <6 mm-dən aşağı düyünlərdə bədxassəli şiş riski <1% təşkil edir.6-20 mm ölçülü düyünlər üçün bədxassəli şiş riski 8%-dən 64%-ə qədərdir30.Buna görə də, Fleischner Cəmiyyəti müntəzəm CT təqibi üçün 6 mm kəsmə diametrini tövsiyə edir.29 Bununla belə, 6 mm-dən böyük qeyri-müəyyən ağciyər düyünlərinin (IPN) risk qiymətləndirilməsi və idarə edilməsi adekvat şəkildə həyata keçirilməmişdir 31 .Anadangəlmə ürək xəstəliyinin cari idarə edilməsi adətən tez-tez CT monitorinqi ilə diqqətli gözləməyə əsaslanır.
Təsdiqlənmiş metaboloma əsaslanaraq, biz ilk dəfə sağlam fərdlər və <6 mm olan xoşxassəli düyünlər arasında metabolomik imzaların üst-üstə düşdüyünü nümayiş etdirdik.Bioloji oxşarlıq 6 mm-dən az olan düyünlərin bədxassəli olma riskinin düyünləri olmayan subyektlər qədər aşağı olması ilə bağlı əvvəlki KT nəticələrinə uyğundur.30 Qeyd etmək lazımdır ki, bizim nəticələrimiz həmçinin <6 mm və ≥6 mm-lik xoşxassəli düyünlərin yüksək olduğunu göstərir. metabolomik profillərdə oxşarlıq, xoşxassəli etiologiyanın funksional tərifinin düyün ölçüsündən asılı olmayaraq ardıcıl olduğunu göstərir.Beləliklə, müasir diaqnostik serum metabolit panelləri KT-də düyünlər ilkin olaraq aşkar edildikdə və potensial olaraq ardıcıl monitorinqi azaldarkən istisna test kimi tək bir analiz təmin edə bilər.Eyni zamanda, metabolik biomarkerlərin eyni paneli ≥6 mm ölçüsündə bədxassəli düyünləri xoşxassəli düyünlərdən fərqləndirdi və CT şəkillərində oxşar ölçülü və qeyri-müəyyən morfoloji xüsusiyyətlərə malik İPN-lər üçün dəqiq proqnozlar verdi.Bu zərdab metabolizması təsnifatı 0,927 AUC ilə ≥6 mm düyünlərin bədxassəliliyini proqnozlaşdırmaqda yaxşı nəticə göstərmişdir.Birlikdə götürdükdə, nəticələrimiz göstərir ki, unikal serum metabolomik imzaları xüsusilə erkən şişin səbəb olduğu metabolik dəyişiklikləri əks etdirə bilər və düyün ölçüsündən asılı olmayaraq risk proqnozlaşdırıcıları kimi potensial dəyərə malikdir.
Qeyd edək ki, ağciyər adenokarsinoması (LUAD) və skuamöz hüceyrəli karsinoma (LUSC) kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçənginin (KHDAK) əsas növləridir.Nəzərə alsaq ki, LUSC tütün istifadəsi ilə güclü şəkildə bağlıdır47 və LUAD KT müayinəsində aşkar edilmiş təsadüfi ağciyər düyünlərinin ən çox yayılmış histologiyasıdır48, bizim təsnifat modelimiz xüsusi olaraq I mərhələ adenokarsinoma nümunələri üçün qurulmuşdur.Wang və həmkarları həmçinin LUAD-a diqqət yetirdilər və erkən mərhələdə ağciyər xərçəngini sağlam insanlardan ayırmaq üçün lipidomikalardan istifadə edərək doqquz lipid imzasını müəyyən etdilər17.Mövcud təsnifat modelini 16 mərhələdə I LUSC və 74 xoşxassəli düyün üzərində sınaqdan keçirdik və LUAD və LUSC-nin öz metabolomik imzalarına malik ola biləcəyini düşünərək aşağı LUSC proqnozlaşdırma dəqiqliyini (AUC 0.776) müşahidə etdik.Həqiqətən də, LUAD və LUSC-nin etiologiyası, bioloji mənşəyi və genetik aberrasiyaları ilə fərqləndiyi göstərilmişdir49.Buna görə də, skrininq proqramlarında ağciyər xərçənginin əhali əsaslı aşkarlanması üçün təlim modellərinə digər histologiya növləri də daxil edilməlidir.
Burada, sağlam nəzarət və xoşxassəli düyünlərlə müqayisədə ağciyər adenokarsinomasında ən çox dəyişən altı yolu müəyyən etdik.Ksantin və hipoksantin purin metabolik yolunun ümumi metabolitləridir.Nəticələrimizə uyğun olaraq, sağlam nəzarət və ya preinvaziv mərhələdə olan xəstələrlə müqayisədə ağciyər adenokarsinoması olan xəstələrin zərdabında və ya toxumalarında purin mübadiləsi ilə əlaqəli ara məhsullar əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır15,50.Yüksək serum ksantin və hipoksantin səviyyələri sürətlə yayılan xərçəng hüceyrələrinin tələb etdiyi anabolizmi əks etdirə bilər.Qlükoza mübadiləsinin pozulması xərçəng metabolizminin tanınmış əlamətidir51.Burada, HC və BN qrupu ilə müqayisədə LA qrupunda piruvat və laktatda əhəmiyyətli bir artım müşahidə etdik ki, bu da kiçik hüceyrəli olmayan ağciyər xərçəngi (KHDAK) xəstələrinin serum metabolom profillərində glikolitik yol anormalliklərinin əvvəlki hesabatlarına uyğundur və sağlam nəzarət.nəticələr ardıcıldır52,53.
Əhəmiyyətli olan, ağciyər adenokarsinomalarının serumunda piruvat və triptofan mübadiləsi arasında tərs korrelyasiya müşahidə etdik.Serum triptofan səviyyələri HC və ya BN qrupu ilə müqayisədə LA qrupunda azalmışdır.Maraqlıdır ki, perspektivli bir kohortdan istifadə edərək əvvəlki geniş miqyaslı bir araşdırma, dolaşan triptofanın aşağı səviyyələrinin ağciyər xərçəngi riskinin artması ilə əlaqəli olduğunu təsbit etdi 54 .Triptofan tamamilə qidadan aldığımız vacib bir amin turşusudur.Belə bir nəticəyə gəldik ki, ağciyər adenokarsinomasında serum triptofanın azalması bu metabolitin sürətlə tükənməsini əks etdirə bilər.Məlumdur ki, kinurenin yolu ilə triptofan katabolizminin son məhsulu de novo NAD+ sintezinin mənbəyidir.NAD+ ilk növbədə xilasetmə yolu ilə istehsal olunduğundan, sağlamlıq və xəstəlikdə NAD+-nın triptofan metabolizmindəki əhəmiyyəti hələ də müəyyən edilməmişdir46.TCGA verilənlər bazası ilə bağlı təhlilimiz göstərdi ki, triptofan daşıyıcısı həlledici daşıyıcı 7A5 (SLC7A5) ifadəsi ağciyər adenokarsinomasında normal nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artıb və qlikolitik ferment GAPDH-nin ifadəsi ilə müsbət əlaqədə olub.Əvvəlki tədqiqatlar əsasən antitümör immun cavabın bastırılmasında triptofan katabolizminin roluna yönəlmişdir40,41,42.Burada göstəririk ki, ağciyər xərçəngi hüceyrələrində SLC7A5-in yıxılması yolu ilə triptofanın qəbulunun qarşısının alınması hüceyrə NAD səviyyələrinin sonrakı azalması və qlikolitik aktivliyin eyni vaxtda zəifləməsi ilə nəticələnir.Xülasə olaraq, tədqiqatımız ağciyər adenokarsinomasının bədxassəli transformasiyası ilə əlaqəli serum metabolizmasında dəyişikliklər üçün bioloji əsas verir.
EGFR mutasiyaları NSCLC olan xəstələrdə ən çox görülən sürücü mutasiyalardır.Tədqiqatımızda aşkar etdik ki, EGFR mutasiyası olan xəstələrdə (n = 41) vəhşi tipli EGFR (n = 31) olan xəstələrə oxşar ümumi metabolomik profillər var, baxmayaraq ki, asilkarnitinli xəstələrdə bəzi EGFR mutant xəstələrinin serum səviyyələrinin azaldığını aşkar etdik.Asilkarnitinlərin müəyyən edilmiş funksiyası asil qruplarını sitoplazmadan mitoxondrial matrisə daşımaqdan ibarətdir ki, bu da yağ turşularının oksidləşməsinə gətirib çıxararaq enerji 55 .Əldə etdiyimiz tapıntılara uyğun olaraq, bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma, 102 ağciyər adenokarsinoma toxuması nümunəsinin qlobal metabolomunu təhlil edərək EGFR mutant və EGFR vəhşi tipli şişlər arasında oxşar metabolom profillərini də müəyyən etdi50.Maraqlıdır ki, EGFR mutant qrupunda asilkarnitin tərkibi də aşkar edilmişdir.Buna görə də, asilkarnitin səviyyələrindəki dəyişikliklərin EGFR-nin səbəb olduğu metabolik dəyişiklikləri və əsas molekulyar yolları əks etdirib-təsvir etməməsi əlavə araşdırmaya dəyər ola bilər.
Yekun olaraq, tədqiqatımız ağciyər düyünlərinin differensial diaqnostikası üçün zərdab metabolik təsnifatını yaradır və riskin qiymətləndirilməsini optimallaşdıra və KT taramasına əsaslanan klinik idarəetməni asanlaşdıra bilən iş axını təklif edir.
Bu tədqiqat Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Xəstəxanasının Etika Komitəsi, Sun Yat-sen Universitetinin Birinci Əlaqəli Xəstəxanası və Zhengzhou Universiteti Xərçəng Xəstəxanasının Etika Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmişdir.Kəşf və daxili yoxlama qruplarında, Sun Yat-sen Universitetinin Xərçəng Mərkəzinin Xərçənglə Mübarizə və Qarşısının Alınması Departamentində illik tibbi müayinədən keçən fərdlərdən sağlam fərdlərdən 174 sera və xoşxassəli düyünlərdən 244 sera və 166 xoşxassəli düyün toplanmışdır.serum.Mərhələ I ağciyər adenokarsinomaları Sun Yat-sen Universitetinin Xərçəng Mərkəzindən toplanmışdır.Xarici qiymətləndirmə kohortunda 48 xoşxassəli düyün, Sun Yat-sen Universitetinin Birinci Əlaqəli Xəstəxanasından 39 mərhələ I ağciyər adenokarsinoması və Zhengzhou Xərçəng Xəstəxanasından 24 I mərhələ ağciyər adenokarsinoması hadisəsi var idi.Sun Yat-sen Universitetinin Xərçəng Mərkəzi, müəyyən edilmiş metabolik təsnifatlandırıcının diaqnostik qabiliyyətini yoxlamaq üçün I mərhələ skuamöz hüceyrəli ağciyər xərçənginin 16 hadisəsini topladı (xəstənin xüsusiyyətləri Əlavə Cədvəl 5-də göstərilmişdir).Kəşf kohortundan və daxili doğrulama kohortundan nümunələr 2018-ci ilin yanvar və 2020-ci ilin may ayları arasında toplanıb. Xarici qiymətləndirmə kohortu üçün nümunələr 2021-ci ilin avqust və 2022-ci ilin oktyabr ayları arasında toplanıb. Gender qərəzliyini minimuma endirmək üçün hər birinə təxminən bərabər sayda kişi və qadın halları təyin edilib. kohort.Kəşf Qrupu və Daxili Nəzarət Qrupu.İştirakçının cinsi öz hesabatına əsasən müəyyən edilmişdir.Bütün iştirakçılardan məlumatlı razılıq alınmış və heç bir kompensasiya verilməmişdir.Xoşxassəli düyünləri olan subyektlər əməliyyatdan əvvəl toplanmış və histopatoloji ilə diaqnoz qoyulmuş xarici təsdiqləmə nümunəsindən 1 hal istisna olmaqla, analiz zamanı 2 ildən 5 ilə qədər stabil CT tarama xalı olan şəxslər idi.Xroniki bronxit istisna olmaqla.Ağciyər adenokarsinoması halları ağciyər rezeksiyasından əvvəl toplanmış və patoloji diaqnozla təsdiq edilmişdir.Aclıq qan nümunələri heç bir antikoaqulyantlar olmadan serum ayırıcı borularda toplandı.Qan nümunələri otaq temperaturunda 1 saat laxtalanmış və sonra serum supernatantını toplamaq üçün 4°C-də 10 dəqiqə 2851 × g-də sentrifuqa edilmişdir.Serum alikotları metabolitlərin çıxarılmasına qədər -80°C-də donduruldu.Sun Yat-sen Universiteti Xərçəng Mərkəzinin Xərçəngin Qarşısının Alınması və Tibbi Müayinə Departamenti 40-55 yaş arasında bərabər sayda kişi və qadın daxil olmaqla 100 sağlam donordan zərdab hovuzu toplayıb.Hər bir donor nümunəsinin bərabər həcmləri qarışdırıldı, nəticədə əldə edilən hovuz bölündü və -80°C-də saxlanıldı.Serum qarışığı keyfiyyətə nəzarət və məlumatların standartlaşdırılması üçün istinad materialı kimi istifadə edilmişdir.
İstinad zərdab və sınaq nümunələri əridilmiş və metabolitlər birləşmiş ekstraksiya üsulundan (MTBE/metanol/su) 56 istifadə edilərək ekstraksiya edilmişdir.Qısaca olaraq, 50 μl serum 225 μl buz kimi soyuq metanol və 750 μl buz kimi soyuq metil tert-butil eter (MTBE) ilə qarışdırıldı.Qarışığı qarışdırın və 1 saat buz üzərində inkubasiya edin.Sonra nümunələr qarışdırıldı və burulğanda daxili standartlara malik 188 μl MS dərəcəli su ilə qarışdırıldı (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin və 13C6-izolösin, Cambridge Isotope Laboratories-dən alınmış).Qarışıq daha sonra 4 °C-də 10 dəqiqə ərzində 15000 × g-də sentrifuqa edildi və aşağı faza müsbət və mənfi rejimlərdə LC-MS analizi üçün iki boruya (hər biri 125 μL) köçürüldü.Nəhayət, nümunə yüksək sürətli vakuum konsentratorunda quruyana qədər buxarlandı.
Qurudulmuş metabolitlər 120 μl 80% asetonitrildə yenidən quruldu, 5 dəqiqə burulğan edildi və 4 ° C-də 10 dəqiqə 15,000 × g-də sentrifuqa edildi.Supernatantlar metabolomik tədqiqatlar üçün mikroinsertlərlə kəhrəba şüşə flakonlara köçürüldü.Ultra-performanslı maye xromatoqrafiya-yüksək ayırdetmə kütlə spektrometriyası (UPLC-HRMS) platformasında hədəfsiz metabolomik analiz.Metabolitlər Dionex Ultimate 3000 UPLC sistemi və ACQUITY BEH Amid sütunu (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) istifadə edərək ayrıldı.Müsbət ion rejimində mobil fazalar 95% (A) və 50% asetonitril (B) olub, hər birində 10 mmol/L ammonium asetat və 0,1% qarışqa turşusu var.Mənfi rejimdə mobil fazalar A və B müvafiq olaraq 95% və 50% asetonitrildən ibarət idi, hər iki fazada 10 mmol/L ammonium asetat var, pH = 9. Qradiyent proqramı aşağıdakı kimi idi: 0-0,5 dəq, 2% B;0,5-12 dəq, 2-50% B;12–14 dəq, 50–98% B;14–16 dəq, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1-20 dəq, 2% B. Sütun 40°C-də, nümunə isə 10°C-də avtomatik nümunə götürəndə saxlanılıb.Axın sürəti 0,3 ml/dəq, enjeksiyonun həcmi 3 μl idi.Elektrosprey ionlaşdırma (ESI) mənbəyinə malik Q-Exactive Orbitrap kütlə spektrometri (Thermo Fisher Scientific) böyük həcmdə məlumat toplamaq üçün tam skan rejimində və ddMS2 monitorinq rejimi ilə birləşdirildi.MS parametrləri aşağıdakı kimi təyin edilmişdir: püskürtmə gərginliyi +3,8 kV/- 3,2 kV, kapilyar temperatur 320°C, qoruyucu qaz 40 arb, köməkçi qaz 10 arb, zond qızdırıcısının temperaturu 350°C, tarama diapazonu 70–1050 m/saat, görüntü imkanı.70 000. Məlumat Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) proqramından istifadə etməklə əldə edilib.
Məlumatın keyfiyyətini qiymətləndirmək üçün hər bir nümunədən 10 μL supernatant alikotunu çıxarmaqla birləşdirilmiş keyfiyyətə nəzarət (QC) nümunələri yaradıldı.UPLC-MS sisteminin sabitliyini qiymətləndirmək üçün analitik ardıcıllığın əvvəlində altı keyfiyyətə nəzarət nümunəsi inyeksiyası təhlil edildi.Keyfiyyətə nəzarət nümunələri daha sonra dövri olaraq partiyaya daxil edilir.Bu işdə zərdab nümunələrinin bütün 11 partiyası LC-MS ilə təhlil edilmişdir.100 sağlam donordan alınan zərdab hovuzu qarışığının alikotları ekstraksiya prosesini izləmək və partiyadan partiyaya təsirləri tənzimləmək üçün müvafiq partiyalarda istinad materialı kimi istifadə edilmişdir.Kəşf kohortunun, daxili doğrulama kohortunun və xarici qiymətləndirmə kohortunun hədəfsiz metabolomik təhlili Sun Yat-sen Universitetinin Metabolomika Mərkəzində aparılmışdır.Guangdong Texnologiya Təhlil və Test Mərkəzinin xarici laboratoriyası da təsnifat modelinin performansını yoxlamaq üçün xarici kohortdan 40 nümunəni təhlil etdi.
Ekstraksiya və rekonstitusiyadan sonra çoxlu reaksiya monitorinqi (MRM) rejimində elektrosprey ionlaşma (ESI) mənbəyi ilə ultra yüksək performanslı maye xromatoqrafiya-tandem kütlə spektrometriyasından (Agilent 6495 üçqat dördqol) istifadə etməklə serum metabolitlərinin mütləq kəmiyyəti ölçüldü.Metabolitləri ayırmaq üçün ACQUITY BEH amid sütunundan (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) istifadə edilmişdir.Mobil faza 10 mmol/l ammonium asetat və 0,1% ammonyak məhlulu ilə 90% (A) və 5% asetonitrildən (B) ibarət idi.Qradiyent proqramı aşağıdakı kimi idi: 0–1,5 dəq, 0% B;1,5-6,5 dəq, 0-15% B;6,5-8 dəq, 15% B;8–8,5 dəq, 15%–0% B;8,5–11,5 dəq, 0%B.Sütun 40 °C-də və nümunə 10 °C-də avtomatik nümunə götürəndə saxlanıldı.Axın sürəti 0,3 mL/dəq və enjeksiyonun həcmi 1 μL idi.MS parametrləri aşağıdakı kimi təyin edilmişdir: kapilyar gərginlik ±3,5 kV, nebulizer təzyiqi 35 psi, qabıq qazının axını 12 L/dəq, qabıq qazının temperaturu 350°C, quruducu qazın temperaturu 250°C, quruducu qazın axını 14 l/dəq.Triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin və ksantin MRM çevrilmələri 205,0-187,9, 87,0-43,4, 89,0-43,3, 135,0-92,3 və 151,0-107 olmuşdur.müvafiq olaraq 9.Məlumatlar Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) istifadə edərək toplanmışdır.Serum nümunələri üçün triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin və ksantin standart qarışıq məhlullarının kalibrləmə əyrilərindən istifadə etməklə ölçüldü.Hüceyrə nümunələri üçün triptofan tərkibi daxili standarta və hüceyrə zülal kütləsinə normallaşdırıldı.
Pik hasilatı (m/z və saxlama müddəti (RT)) Compound Discovery 3.1 və TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) istifadə edərək həyata keçirilmişdir.Partiyalar arasında potensial fərqləri aradan qaldırmaq üçün nisbi bolluğu əldə etmək üçün sınaq nümunəsinin hər bir xarakterik zirvəsi eyni partiyadan olan istinad materialının xarakterik zirvəsinə bölündü.Standartlaşdırmadan əvvəl və sonra daxili standartların nisbi standart kənarlaşmaları Əlavə Cədvəl 6-da göstərilmişdir. İki qrup arasındakı fərqlər saxta kəşf dərəcəsi (FDR<0.05, Wilcoxon imzalı dərəcə testi) və qat dəyişməsi (>1.2 və ya <0.83) ilə xarakterizə edilmişdir.Çıxarılan xüsusiyyətlərin xam MS məlumatları və istinad serumla düzəldilmiş MS məlumatları müvafiq olaraq Əlavə Məlumat 1 və Əlavə Məlumat 2-də göstərilmişdir.Pik annotasiya müəyyən edilmiş metabolitlər, ehtimala görə annotasiya edilmiş birləşmələr, ehtimalla xarakterizə edilən mürəkkəb siniflər və naməlum birləşmələr daxil olmaqla, identifikasiyanın dörd müəyyən edilmiş səviyyəsi əsasında həyata keçirilmişdir 22 .Compound Discovery 3.1-də (mzCloud, HMDB, Chemspider) verilənlər bazası axtarışlarına əsasən, MS/MS təsdiq edilmiş standartlara uyğun gələn bioloji birləşmələr və ya mzCloud-da (bal > 85) və ya Chemspider-də dəqiq uyğunluq annotasiyaları, nəhayət, diferensial metabolom arasında ara məhsullar kimi seçildi.Hər bir xüsusiyyət üçün pik annotasiyalar Əlavə Məlumat 3-ə daxil edilmişdir. MetaboAnalyst 5.0 cəmi normallaşdırılmış metabolit bolluğunun birdəyişənli analizi üçün istifadə edilmişdir.MetaboAnalyst 5.0 həmçinin əhəmiyyətli dərəcədə fərqli metabolitlərə əsaslanaraq KEGG yolunun zənginləşdirilməsi təhlilini qiymətləndirdi.Əsas komponent təhlili (PCA) və qismən ən kiçik kvadratların diskriminant təhlili (PLS-DA) yığının normallaşdırılması və avtomatik miqyaslama ilə ropls proqram paketindən (v.1.26.4) istifadə edərək təhlil edilmişdir.Düyün bədxassəliliyinin proqnozlaşdırılması üçün optimal metabolit biomarker modeli ən az mütləq daralma və seçim operatoru (LASSO, R paketi v.4.1-3) ilə binar logistik reqressiyadan istifadə etməklə yaradılmışdır.Aşkarlama və doğrulama dəstlərində diskriminant modelinin performansı pROC paketinə (v.1.18.0.) uyğun olaraq ROC təhlili əsasında AUC-nin qiymətləndirilməsi ilə xarakterizə edilmişdir.Modelin maksimum Youden indeksi (həssaslıq + spesifiklik – 1) əsasında optimal ehtimal kəsimi əldə edilmişdir.Dəyərləri həddən az və ya böyük olan nümunələr müvafiq olaraq xoşxassəli düyünlər və ağciyər adenokarsinoması kimi proqnozlaşdırılacaq.
A549 hüceyrələri (#CCL-185, American Type Culture Collection) tərkibində 10% FBS olan F-12K mühitində yetişdirildi.SLC7A5-i hədəfləyən qısa saç sancağı RNT (shRNA) ardıcıllığı və hədəf təyin olunmayan nəzarət (NC) lentiviral vektor pLKO.1-puroya daxil edilmişdir.shSLC7A5-in antisens ardıcıllığı aşağıdakı kimidir: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).SLC7A5 (#5347) və tubulinə (#2148) antikorlar Cell Signaling Technology-dən alınıb.SLC7A5 və tubulinə qarşı antikorlar Western blot analizi üçün 1:1000 nisbətində seyreltmədə istifadə edilmişdir.
Seahorse XF Glikolitik Stress Testi hüceyrədənkənar turşulaşma (ECAR) səviyyələrini ölçür.Təhlildə ECAR ilə ölçülən hüceyrə qlikolitik qabiliyyətini yoxlamaq üçün qlükoza, oliqomisin A və 2-DG ardıcıl olaraq tətbiq olundu.
Hədəflənməyən nəzarət (NC) və shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ilə transfeksiya edilmiş A549 hüceyrələri bir gecədə 10 sm diametrli qablara qoyuldu.Hüceyrə metabolitləri 1 ml buz kimi soyuq 80% sulu metanol ilə ekstraksiya edilmişdir.Metanol məhlulunda olan hüceyrələr kazınmış, yeni bir boruya yığılmış və 4°C-də 15 dəqiqə 15000 × g-də sentrifuqa edilmişdir.800 µl supernatant toplayın və yüksək sürətli vakuum konsentratorundan istifadə edərək qurudun.Qurudulmuş metabolit qranulları yuxarıda təsvir olunduğu kimi LC-MS/MS istifadə edərək triptofan səviyyələri üçün təhlil edilmişdir.A549 hüceyrələrində (NC və shSLC7A5) hüceyrə NAD(H) səviyyələri istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq kəmiyyət NAD+/NADH kolorimetrik dəstdən (#K337, BioVision) istifadə edilərək ölçüldü.Metabolitlərin miqdarını normallaşdırmaq üçün hər bir nümunə üçün protein səviyyələri ölçüldü.
Seçmənin ölçüsünü ilkin olaraq müəyyən etmək üçün heç bir statistik metoddan istifadə edilməmişdir.Biomarkerin kəşfinə yönəlmiş əvvəlki metabolomik tədqiqatlar15,18 ölçülərin müəyyən edilməsi üçün etalon hesab edilmişdir və bu hesabatlarla müqayisədə bizim nümunəmiz adekvat idi.Tədqiqat kohortundan heç bir nümunə çıxarılmadı.Serum nümunələri təsadüfi olaraq bir kəşf qrupuna (306 hal, 74,6%) və məqsədsiz metabolomik tədqiqatlar üçün daxili qiymətləndirmə qrupuna (104 hal, 25,4%) təyin edildi.Məqsədli metabolomik tədqiqatlar üçün müəyyən edilmiş kəşfdən hər qrupdan təsadüfi olaraq 70 hadisə seçdik.Tədqiqatçılar LC-MS məlumatlarının toplanması və təhlili zamanı qrup tapşırığına kor idi.Metabolomik məlumatların və hüceyrə təcrübələrinin statistik təhlilləri müvafiq Nəticələr, Şəkil Əfsanələri və Metodlar bölmələrində təsvir edilmişdir.Hüceyrə triptofan, NADT və qlikolitik aktivliyin kəmiyyəti eyni nəticələrlə üç dəfə müstəqil olaraq aparılmışdır.
Tədqiqat dizaynı haqqında daha çox məlumat üçün bu məqalə ilə əlaqəli Təbii Portfolio Hesabat Abstraktına baxın.
Çıxarılan xüsusiyyətlərin xam MS məlumatları və istinad serumunun normallaşdırılmış MS məlumatları müvafiq olaraq Əlavə Məlumat 1 və Əlavə Məlumat 2-də göstərilmişdir.Diferensial xüsusiyyətlər üçün pik annotasiyalar Əlavə Məlumat 3-də təqdim olunur. LUAD TCGA verilənlər bazası https://portal.gdc.cancer.gov/ saytından endirilə bilər.Qrafikin qurulması üçün giriş məlumatları mənbə məlumatlarında verilir.Bu məqalə üçün mənbə məlumatları təqdim olunur.
Milli Ağciyər Skrininq Tədqiqat Qrupu və s. Aşağı dozalı kompüter tomoqrafiyası ilə ağciyər xərçəngindən ölüm hallarının azaldılması.Şimali İngiltərə.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR və Peyğəmbər, PC Aşağı dozalı spiral CT istifadə edərək ağciyər xərçənginin skrininqi: Milli Ağciyər Skrininq Tədqiqatının (NLST) nəticələri.J. Med.Ekran 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Təsadüfi bir sınaqda həcmli CT skrininqi ilə ağciyər xərçəngi ölümünün azaldılması.Şimali İngiltərə.J. Med.382, 503–513 (2020).
Göndərmə vaxtı: 18 sentyabr 2023-cü il